总微生物细胞数

将储存在乙醇中的第3年样品中的10μL加入到990μL过滤器灭菌的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Oxoid）中，并通过在100×浓缩的二甲基亚砜中添加50μL的SYBR Gold核酸染色剂来染色细胞（ DMSO）（Invitrogen Ltd.，Paisley，UK），用箔包裹并在室温下孵育30分钟，之后使用无菌Millipore过滤器支架和0.2mm孔径的黑色聚碳酸酯过滤器（直径25）过滤它们。 mm; Millipore）。将滤膜转移到含有一滴Citifluor（Citifluor Ltd.，Canterbury，United Kingdom）抗褪色剂的玻璃显微镜载玻片上，以帮助粘附到载玻片上。将另一滴Citifluor置于过滤器的顶部，并将盖玻片小心地放置在制剂的顶部。使用Olympus BX40落射荧光显微镜，通过油浸物镜（100×放大倍数）下的直接计数测定总细菌数; 使用稀释产生20个随机选择的视野，所述稀释产生30至300个具有清晰轮廓和有限细胞形状的荧光细胞。使用每次处理测量的三次重复的平均值的标准偏差估计样品之间的误差。通过考虑过滤膜的数量和视野面积，膜的面积和原始样品稀释因子来确定每g土壤的细胞数。使用稀释产生20个随机选择的视野，所述稀释产生30至300个具有清晰轮廓和有限细胞形状的荧光细胞。使用每次处理测量的三次重复的平均值的标准偏差估计样品之间的误差。通过考虑过滤膜的数量和视野面积，膜的面积和原始样品稀释因子来确定每g土壤的细胞数。使用稀释产生20个随机选择的视野，所述稀释产生30至300个具有清晰轮廓和有限细胞形状的荧光细胞。使用每次处理测量的三次重复的平均值的标准偏差估计样品之间的误差。通过考虑过滤膜的数量和视野面积，膜的面积和原始样品稀释因子来确定每g土壤的细胞数。14

土壤呼吸

通过监测含有15g湿重未经修正的，PAC修正的或GAC修正的土壤的50-mL卷曲顶部小瓶中的CO 2浓度来测量第3年样品的土壤呼吸。对于每种土壤类型，在室温（20℃）下监测重复批次4天。在与具有HP-PLOT-Q毛细管柱的Fisons MD800 MS连接的Fisons 8060 GC上进行CO 2的 GC-MS分析。

细菌群落分析

进行指纹方法，变性梯度凝胶电泳（DGGE），以确定实验处理中主要细菌群落之间的相似性和差异，并鉴定这些群落的选定成员。从在储存（不含乙醇）土壤样品的0.5g（湿重）等分试样中提取总细菌DNA，在蒸渗仪实验开始后0和6个月和3年时取得。使用Fast DNA Soil Kit（Qbiogene）进行DNA提取，纯化步骤，由Griffiths等人的方法修改，15在核酸提取之前加入，以防止已知抑制PCR扩增的化合物如腐殖酸和粘土矿物的共提取。简而言之，预处理包括使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，Sigma-Aldrich）提取缓冲液和苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1，Sigma-Aldrich）从土壤基质中提取核酸，然后使用苯酚用氯仿/异戊醇（24：1，Sigma-Aldrich）除去。引物2和3，靶向细菌，使用PCR扩增的细菌的16S rRNA基因片段的V3区域，如先前通过Muyzer等人，描述16和如先前所描述的PCR产物通过DGGE分析。13使用图像分析软件BioNumerics（Applied Maths NV，St.Martens-Latem，Belgium）对DGGE图像进行标准化和解释。引物6（Primer-E Ltd.，Plymouth，UK）用于使用Pearson积矩相关系数和相似性分析（ANOSIM）进行聚类分析。

波段测序

从凝胶上切下显性DGGE条带，使用引物2/3进行PCR扩增，纯化并使用ABI prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready反应试剂盒和ABI Prism用引物2或3（3.2pmol /μes/μL）测序。如前所述的377 DNA测序仪（Applied Biosystems，USA）。13使用BLAST算法将核酸序列数据库项目（RDP10）和GenBank数据库的序列进行比较，以确定最接近的匹配序列同一性。

定量实时PCR

特定环羟基化双加氧酶α亚单位的丰度（RHD α）基因通过实时PCR在每个样品中使用以下引物组测量：（ⅰ）P6B（正向（F）：5'-TGGCGAACTCGTGTCGGCAC-3';反向（r）：5'-CGTCCAGRCAACCGAADAYC -3'），靶向pdoA2 / phdA进化枝，其主要包括分枝杆菌属物种并且具有M.vanbaalenii作为参考菌株; （ii）P4（f：5'-CCGGAGACTTCCTGACGAC-3'; r：5'-GCASACGAAYCGACGGGT-3'）靶向ebdA1 / etbA1 / akbA1b进化枝，其仅包括红球菌属物种并且具有R.jostii RHA1作为参考菌株; （iii）P7B（f：5'-CACBTGCAGCTAYCACG -3'; r：5'-CATGTGGTCCATGTAGAAC -3'）靶向aipbA1 / bphA1进化枝，主要包括红球菌和一些假单胞菌属，特别是包括几种红细胞内红细胞。株。使用C1000热循环仪iCycler和软件版本1.6（BioRad CFX Manager）在BioRad CFX96（Hercules，CA）上进行实时PCR实验。10μL反应混合物含有3μL模板DNA（或过滤的无菌分子生物学水，Sigma-Aldrich，作为阴性对照）和15pmol的每种引物，其中SsoFast EvaGreen Supermix用于CFX96（Biorad Laboratories Ltd.）。在扩增中使用以下温度曲线：步骤1加热至98℃（2分钟），然后进行40个循环，在98℃下变性2秒，在引物特异性退火温度下5秒（P6B为58℃） ，P4为60°C，P7B为59°C）。在实时PCR结束时，进行解链曲线作为最终步骤，其包括在0期间测量SYBR Green信号强度。在65至95°C之间每10秒钟升温2°C。荧光与温度变化的对应曲线显示每个扩增子在其特定解链温度下的单峰。对于每组引物，从由含有克隆的靶序列的质粒制备的标准DNA获得校准曲线。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）定量质粒DNA浓度。根据质粒大小，插入物长度和假设每个碱基对的分子量为660Da计算标准质粒的拷贝数。制备标准DNA的储备溶液，浓度为10 从含有克隆的靶序列的质粒制备的标准DNA获得校准曲线。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）定量质粒DNA浓度。根据质粒大小，插入物长度和假设每个碱基对的分子量为660Da计算标准质粒的拷贝数。制备标准DNA的储备溶液，浓度为10 从含有克隆的靶序列的质粒制备的标准DNA获得校准曲线。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Scientific）定量质粒DNA浓度。根据质粒大小，插入物长度和假设每个碱基对的分子量为660Da计算标准质粒的拷贝数。制备标准DNA的储备溶液，浓度为10质粒μL -1的9个拷贝。对于校准曲线，通过稀释储备溶液制备范围为10 9至10 1个靶基因拷贝μL - 1的 DNA标准品。所有标准曲线在9个数量级（10 9至101μL - 1）内呈线性（R 2 > 0.99））基因拷贝数。每个样品一式三份进行，每个实验重复至少两次。在每次运行中，通过比较qPCR产物的熔解曲线和琼脂糖分析与从模式生物中提取的DNA（阳性对照）获得的精确度来确认土壤样品中靶基因检测的准确性，以避免环境样本中的错误检测。

PAH的可用性由聚乙烯取样器吸收评估

建立了一系列批量实验来研究被动采样器中可利用的PAHs的摄取。13被动采样器能够从被污染的水中被动地积聚HOC，直到建立分区平衡。通过被动采样吸收污染物潜在地也可用于摄取临界受体如植物和蚯蚓（图（图1，1，方法III）。为了研究单独吸附（图的影响（图1，1，方法I ）相比吸附和生物降解的组合效果（图（图1，1关于污染物可用性的过程i和v），在添加和不添加叠氮化物的情况下建立批次，其抑制PAH生物降解。17，18微观世界包括以下内容：5克（湿重）未改良土壤，PAC修正土壤或GAC修正土壤和40毫升水。样品的水含量为16至21％湿重。对于每种土壤类型，在有和没有1g / L叠氮化钠（Sigma Aldrich）的情况下建立三个批次。每批加入0.15±0.01克清洁聚乙烯（PE）被动采样器。空白对照平行进行，由含有PE取样器和含有和不含叠氮化钠的水的三份批次组成。将批次用棉球塞住，并在轨道振动器（IKA labortechnik，德国）上以100rpm的速度在一个二级黑暗容器中混合，所述二级暗容器由纸板箱组成，其中一些孔被冲入盖子中用于通风。3周后除去PE取样器，并在10mL 50：50v：v己烷/丙酮中萃取两次，持续24小时。d 10 -菲，83±6％的d 10 -芘，为92±4％d 12 -benzanthracene，和94±8％d 12 -benzperyl。

主要细菌群落结构的变化

主要的土壤细菌群落结构，通过DGGE和0后修正和未修正的土壤的聚类分析，6和36个月评估（图（Figure3），3），表明所有各特定时间周期将样品紧密聚集来自同一时期的其他样本，无论治疗如何。这表明主要的细菌群落结构随时间的变化比对PAC或GAC修正的响应更强（ANOSIM测试时间组之间的差异，全球R = 0.852，p <0.01;对于治疗之间的差异，全球R = -0.317，p= 0.97）。总体而言，主要的细菌群落，通过皮尔逊积矩相关系数确定之间的相似性，大于65％（图（Figure3b）。3 b）中。从相同的时间点和治疗重复DNA样品显示出更高的相似性（> 77整体％，平均相似系数> 87％，图Figure3b），3b），表明良好的方法重现性。最丰富的微生物物种是土壤中碳和养分循环的重要驱动因素。本研究中观察到的AC修正和未修复土壤中主要细菌群落结构的相似性相当高，减轻了对AC修正的强烈副作用的担忧。这些发现与沉积物无脊椎动物场社区调查同意其中AC修正案通常只有在群落结构和多样性，弱影响23，24虽然在一个领域研究中观察到物种丰富清晰的效果。24

 

图3

（a）DGGE凝胶显示切除条带的位置，与三类环境细菌相对应（右实心三角形=放线菌;◊=变形菌;□=拟杆菌;●=未知）。最匹配的序列在支持信息的表S1中报告。在零时间，6个月和3年时，从未修饰的和AC修正的土壤（PAC，GAC）中提取DNA两次（DNA1和DNA2）。（b）树状图显示了DGGE检测的治疗的不同群落组成随时间的相似性（Pearson积矩相关系数）的聚类分析。

条带测序结果

使用基本局部比对搜索工具（BLAST）鉴定与测序的DGGE条带最接近的匹配邻居，并使用核糖体数据库项目（RDP 10）中的分类器工具确认分类。二十三的26最主要类群测序并分为三个主要的类群，拟杆菌，放线菌，和变形菌（由不同的符号识别，图Figure33和表S1 支持信息）窝藏已知常见环境细菌在有机物分解中起重要作用。25 - 28三种最丰富和普遍的分类群（带N6，N10，N17和分别）属于顺序Micrococcinaea的内放线菌门，其最近的邻居被确定为一个Curtobacterium属，节杆菌，和微杆菌物种虽然具有变化的相似性（89-99％ ; 支持信息中的表S1 ）。这些细菌是常见的土壤居民。几个主要丰富（强带）分类群的最近匹配邻居是有意义的，因为据报道在这些分类群的成员中降解PAHs具有广泛的能力（例如，（29））：N7带与分枝杆菌 96％相同SP。和92％类似多功能PAH降解M. vanbaalenii PYR-1，30，31带N8是类似于通用的PAH降解95％红球菌josttii应变RHA1，32带N16 95％是相同的一个未经培养鞘氨醇藻。和带N23是类似于物种的菌株99％红串红球菌，是已知的成员降解联苯和异丙基苯（例如，参考文献（33，34））。这些基团通常存在于所有土壤（例如，（35）），但似乎在污染土壤频繁支配多个（例如，（36，37）），尽管据我们所知，获得与含有分枝菌酸的放线菌（例如，红球菌和分枝杆菌）匹配的序列的这种优势是不寻常的。这些条带存在在从未经修正的，PAC-细菌群落的所有次，和GAC-修正土壤，但它们的相对强度随时间变化（见表表1）。1）。条带的相对强度可以提供社区中这些分类群的比例丰度的粗略代表。这些条带在第3年的相对强度平均强于研究开始时的相对强度，但在处理之间相当，这表明这些推定的PAH降解类群在土壤中具有相似的相对丰度。该R. jostii RHA-1样序列（N8带）在研究开始和结束之间显示出特别显着的强度增加，其中从主要细菌群落的约3％增加到近10％，如AC修正的相对强度所表示的和未经修正的土壤。

实时PCR结果

实时PCR是用于定量功能性PAH环羟基化双加氧酶的有价值的工具。38，39双加氧酶系统的分子氧的两个原子与芳香环添加为较低分子量的多环芳烃的需氧降解的第一步，和双加氧酶基因的定量因此在PAH生物修复可能性进行评估的兴趣。40，41的RHD α报道在表基因拷贝数表22表明，由基准表示的那些红球菌 RHA1物种（从这里通称为ETBA RHA1 -RHD α）显示了最高的浓度（约107 -10 8克-1），而那些用a表示红串红球菌参考物种（从这里通称为IPDA Reryth -RHD α）表现出最低的浓度（约10 5 -10 6克-1）对于每治疗。那些由附图表示结核分枝vanbaalenii PYR1物种（从这里通称为pdoA2 PYR1 -RHD α）具有中间浓度（〜10 6 -10 7克-1）。这些推定的芳环降解细菌（即，RHD α如果假定每个细菌细胞含有一个基因拷贝，则分析的细菌占总细菌群体的0.003和1％之间。这些值类似于Cebron等人报道的绝对和相对丰度值。39使用定量PCR靶向受污染土壤中的一般双加氧酶基因群体，但高于仅针对特定双加氧酶基因群体的研究。42 - 44每个目标基因的浓度未修改土壤之间的数量级内下降，土壤修正与PAC和土壤与GAC修正。事实上，主要的ETBA RHA1 -RHD α基因群体在试验期间增加，并且与未修饰的渗透计相比在AC修正中更大程度地增加。这证实具有降解PAHs能力的细菌保留在PAC和GAC修正的土壤中，其水平与未修饰土壤中的种群相当。实时PCR方法测量基因数量，或降低PAHs的潜力，而不是基因表达，可能会被某些污染物降解剂下调。45换言之，而结果表明，以合成双加氧酶的能力是存在于从土壤样品中分离的所有的细菌群落，而不管AC修正，这并不一定意味着酶的活性合成。有趣的是，要注意的是有针对性的RHD之间的显著相关α基因丰度和由有密切的隶属关系的那些RHD的参考物种DGGE分析（相对强度×总细胞计数）中找到的那些分类群的浓度α基因（Pearson相关，- [R 2 = 0.83，P <0.01，Ñ = 9） 。然而，尽管有用于RHD的每个目标进化枝参考物种这些16S rRNA基因片段的密切联系α，所述相似性往往比通常用于物种水平那些截止值低（例如，92-96％）（97％ ），它不能自信地认为，这些类群必然包含RHD α基因，即使它们被认为是相似的类群。

假设每细胞310 FG的碳含量46和一个ETBA RHA1 -RHD α每个细胞的基因拷贝，对应于表的基因拷贝数的生物质碳表22将是每克干土40和70之间微克，这大于固相PAH浓度，远大于每克土壤低于1 ng的自由溶解PAH浓度。8比较表明，含有双加氧酶基因的微生物利用了其他主要的碳底物，因此可以在有和没有AC修正的土壤中长期生长和持续存在。该研究结果缓解了AC增强的PAH结合可能导致AC修正土壤中推定的PAH降解物丰度显着降低的担忧。