OSPW的臭氧化。

Wang等人先前已经报道了臭氧化程序的详细描述。（29）。简言之，通过使用臭氧发生器（型号GSO-40; PCI-WEDECO，Herford，Germany）从外部和高纯度氧气产生臭氧来进行原料OSPW的臭氧化。将臭氧浓度为〜150mg /升的气体混合物（臭氧和氧气）送入位于含有原料OSPW的200升塑料桶底部的陶瓷细泡气体扩散器。在OSPW臭氧化期间，通过两个相同的臭氧监测器（型号HC-500; PCI-WEDECO）连续监测进料和废气管线中的臭氧浓度。使用纯氮吹扫残留的臭氧（未反应，在OSPW中物理吸收），并记录废气管线臭氧浓度。根据标准方法，使用Indigo方法估算残余臭氧（30）。使用30mg O 3 /升的臭氧剂量用于OSPW的臭氧化以将NA浓度降低40％至50％（如下文“水质参数”中所述测定），从而允许残留的NA用于生物降解。

生物膜生长实验方法。

GAC表面上的生物膜培养在室温（21±1℃）和150rpm的水平振荡器上进行，处理封闭在含有2g GAC和500ml原料或臭氧的1升琥珀色瓶中。 OSPW（Innova 2100平台振动筛; New Brunswick Scientific，USA）。对于生物膜生长启动，使用处理原料OSPW（n = 4）的反应器而不添加任何细菌接种物，而处理臭氧化OSPW的反应器（n）在开始实验之前，用内源性原始OSPW细菌培养物（5ml）接种，以在不存在内源性细菌的情况下促进生物膜生长，所述内源性细菌可能在臭氧化过程中被减少或消除。最初，所有反应器以分批模式运行4天以允许细菌附着在GAC表面上。随后，反应器以分批模式操作，每隔一天连续交换原始和臭氧化的OSPW，直到生物膜生长达到稳定状态（第48天;参见补充材料中的图S1）。在这种稳定的生物膜生长状态之后，用新鲜的生物和臭氧化的OSPW进行了2天的实验，以观察从组合的吸附和生物降解机制中去除有机物（n每次治疗= 2。为了仅观察吸附机理，使用0.1％（wt / vol）叠氮化钠抑制GAC表面上的生物膜生物降解，并且用生（n = 2）和臭氧化（n = 2）OSPW进行实验。使用这两种方法，生物降解机制的影响只能通过组合和仅吸附实验中的测量之间的差异来计算。

用灭菌的移液管一式三份收集来自每个反应器的液体样品，并分析COD，AEF和NA。为了从反应器中收集GAC生物膜样品，通过轻轻地倒出OSPW从处理过的OSPW中分离GAC，并使用预灭菌的勺子从反应器中取出GAC。然后通过异养平板计数（HPC）（n = 3），共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）（n = 4）和DNA提取（n = 2）分析GAC生物膜。

使用HPC进行细菌计数。

HPC使用滴板法进行细菌计数（31）用于原始和臭氧化的OSPW，它们各自的生物膜是在GAC表面上开发的。为了从生物膜中提取细菌，将质量（0.5至1.0g）的GAC生物膜置于15ml无菌管中的2ml无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，并使用涡旋混合1分钟。对于OSPW和提取的生物膜样品，进行一系列（7系列）10倍稀释，并将10μl每种稀释液一式三份涂布在R2A（Difco）琼脂培养板上。将板在37℃温育，在24,48和72小时进行细菌CFU的计数。对于生物膜样品，将计数转换成每克生物膜GAC的细菌CFU。使用0.05的显着性水平（α）使用方差分析（ANOVA）进行HPC的统计学分析。

CLSM成像。

GAC样品每6天从原始和臭氧化的OSPW处理中取出用于GAC生物膜分析。GAC生物膜用SYTO 9（BacLight Live / Dead细菌活力试剂盒; Molecular Probes，USA）和刀豆蛋白A（ConA; Molecular Probes，Eugene，OR）凝集素与德克萨斯红共染色，用于探测活细胞和细胞外聚合物（EPS），分别为（32）。用CLSM（Zeiss LSM 710; Carl Zeiss Micro Imaging GmbH，Germany）进行生物膜图像观察，采集和生物膜厚度测量。使用Zeiss Plan-Apochromat透镜（×20放大倍数，0.8数值孔径）在4或5个位置随机观察和扫描图像。Hwang等人先前描述了详细的程序。（22）。

DNA提取，qPCR和454焦磷酸测序。

使用PowerSoil DNA分离试剂盒（MOBIO Laboratories Inc.，Carlsbad，CA）一式两份从细菌细胞中分离DNA。通过以10,000rpm离心原始和臭氧化的OSPW 10分钟（Multifuge3S / 3S-R; Heraeus，Thermo Scientific，USA）将浮游细菌分离为沉淀。收集沉淀并加入动力土珠管中以分离总基因组DNA。为了从GAC生物膜中分离DNA，将大量GAC（0.5至1.0g）直接添加到动力土珠管中。按照制造商的方案分离总基因组DNA。使用含有1×SsoFast EvaGreen supermix的CFX 96 Touch实时PCR系统（Bio-Rad Laboratories Inc.，USA）一式三份进行定量实时PCR（qPCR），每种引物浓度为0.5μM（Integrated DNA） Technologies，Coralville，IA），在25μl总反应体积内加入5μl稀释的DNA。用于在qPCR期间扩增提取的DNA的引物组由907r（5'-CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3'）和341f（5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3'）组成。使用ANOVA在0.05的显着性水平（α）下统计分析qPCR数据。

DNA提取后，使用28F和519R引物（分别为GAGTTTGATCNTGGCTCAG和GTNTTACNGCGGCKGCTG）和Qiagen热启动主混合物通过PCR扩增16S rRNA基因的V1至V3区域。将DNA在95℃变性5分钟，然后在94℃下30秒，54℃下45秒和72℃下60秒进行35个循环。最后，在72℃下进行延伸反应10分钟。如先前所述（33），使用得自德克萨斯州Lubbock的研究和测试实验室的454 / Roche GS-FLX仪器对扩增的DNA进行测序和分析。自动化管道用于处理原始454序列数据。去皮（USEARCH应用）和嵌合体去除后（UCHIIME de novo模式），使用USEARCH（34）将序列聚类成具有100％同一性（0％分歧）的操作分类单元（OTU）聚类。对于分类学鉴定，种子序列使用分布式.NET算法从NCBI衍生。基于上述BLASTn +衍生的序列同一性百分比，基于补充材料中详述的标准将序列分类在适当的分类学水平。

还通过核糖体数据库项目（RDP）焦磷酸测序管道（35）处理修剪序列。在应用RDP聚类功能之前，使用RDP对准器工具进一步对齐样品的序列。提交所得聚类以计算Chao1估计量，Shannon-Weaver（H'）指数均匀度，以及3％不相似水平的稀疏曲线，其被认为与物种水平近似相关。RDP丰度统计工具还用于计算基于Jaccard方法的样本之间的差异（36），并通过使用具有算术平均值（UPGMA）的未加权对组方法构建3％不相似的距离矩阵。

（ii）GAC生物膜中微生物群落的定量。

图1显示了在48天实验期间，原始和臭氧化OSPW的qPCR（图1A）和HPC（图1B）分析的细菌生长结果。对于两种处理，在第6天观察到GAC表面上的细菌附着。对于这两种分析，细菌生长在GAC生物膜中增加，直到qPCR第30天和HPC分析第48天达到平台。使用qPCR计算的最终细菌浓度为原始和臭氧化OSPW的~ 10 9拷贝/ g GAC（图1A）。两种处理的生长模式趋势随时间变化相似，并且丰度彼此没有显着差异（ P = 0.008）。Reaume等人之前的一项研究。（ 42）在用于使用ATP分析连续处理城市废水的生物过滤器中，在GAC生物膜中显示出更高密度的细胞/克GAC（4×10 10）。然而，使用不同的方法和废水可能归因于在当前实验中在GAC表面上观察到的10倍低的细菌拷贝数。HPC细菌菌落生长随着时间的推移而增加，并且在第30天达到两个处理的平台期（图1B）。原始和臭氧化的OSPW 的可培养细菌的初始数量（第0天）分别为2×10 3 CFU / ml和3×10 3 CFU / ml。在第30天和第48天，两种处理均有~ 10 7 CFU / g的GAC（图1B）。虽然最终的细菌生长指标不能直接在qPCR和HPC方法之间进行比较，但每种方法可靠地检测细菌生长的能力对于一致性分析非常重要。与通过qPCR检测的那些相比，常规的培养依赖性微生物学方法通常代表约1％至5％的细菌菌落。Naz等人先前报道了类似百分比的HPC细菌生长（1％至10％）。（43）。

图。1

对于原始和臭氧化的OSPW GAC处理，GAC表面上的细菌生长超过48天。（A）qPCR方法（细菌拷贝数）; （B）异养平板计数法（细菌CFU）。值是平均值（n = 3），误差线表示标准偏差。

用于原料和臭氧化OSPW处理的GAC表面上的细菌生长是在不向反应器中添加外部有机食物源的情况下完成的。因此，OSPW的有机物每隔一天就会提供微生物群落代谢需求。GAC表面获得含有高细菌浓度的生物膜的能力可归因于（i）不规则，粗糙和高度多孔的表面形态，其可通过提供对高流体剪切力的保护来增强细菌定植（44） ，和（ii）GAC的高吸附能力（高孔隙率），这增加了底物，氧气和营养素的可用性，从而吸引细菌到GAC表面（45）。

微生物群落结构表征。

通过浮游生物OSPW和GAC生物膜样品的焦磷酸测序鉴定的门的相对丰度如图2所示。测序的细菌门由Proteobacteria，Nitrospirae，Acidobacteria，Verrucomicrobia，Bacteroidetes，Chloroflexi等组成（图2）。变形菌是最丰富的所有样品中，用约40，60，70，和90％的臭氧化OSPW，生OSPW，臭氧GAC生物膜和原始GAC生物膜（总细菌丰度图2A至TOD），d），分别。该Hwang等人报道，PE和PVC上的OSPW生物膜也含有丰富的变形菌。（22）和Golby等报道的卡尔加里生物膜装置。（27）。有趣的是，臭氧处理相对于类似的原始处理，相对Proteobacteria序列丰度降低了10％至20％。相比之下，酸性细菌和拟杆菌序列更为丰富，臭氧化OSPW样品中的含量分别为18％和13％，而原始OSPW样品分别为8％和5％。酸菌增加对于臭氧化的OSPW样品，可归因于原始OSPW的臭氧化形成可生物降解的酸性组分，导致优先选择该门（22）。Proteobacteria的生长（~90％）和臭氧化（~70％）OSPW生物膜的丰度高于浮游生物（~60％）和臭氧化（~40％）OSPW。GAC生物膜样品中Proteobacteria丰度的增加可能是由于该门对该处理的GAC表面上富含NAs的毒性和该门的广泛降解能力的抵抗所致。以前，Yergeau等人。（46）发现变形菌丰度与好氧生物膜中的NAs浓度正相关。因此，随着臭氧化降低OSPW毒性，臭氧化处理中GAC表面上有机物的吸附可能降低了GAC表面毒性，导致其他门的丰度增加。此外，两种生物膜之间微生物群落的差异可能是由于有机基质组成，浮游微生物群落多样性和细菌表面聚合物（如脂多糖）物理化学性质的变化（47）。所述门变形菌占已知其具有极端代谢多样性原核属的超过40％（48）。许多这种门的细菌在生态学上很重要，因为它们在碳，硫和氮循环中起着关键作用（48）。此外，Athabasca流域和沉积物的主要微生物属于Proteobacteria，已知它可以降解顽固的沥青化合物（46）。因此，鉴于这种生态重要性及其在当前样品中的总体丰度，考虑了Proteobacteria类的进一步分析（图3）。该变形菌丰度主要由订单的α-变形菌，β-变形菌，γ-变形菌，和Deltaproteobacteria（图3A）。臭氧化的GAC生物膜和原始和臭氧化的OSPW样品表现出相似的这些组的丰度，除了臭氧化的GAC生物膜样品中的Deltaproteobacteria丰度是边缘的。原始OSPW GAC生物膜中的优势类是Gammaproteobacteria，占总丰度的近60％。我们的结果与先前报道的在有氧生长的生物膜中的Gammaproteobacteria组合物（~20％）不同，使用旋转环形生物膜反应器和Athabasca River沉积物作为接种物测定（24）。OSPW的臭氧化导致Alphaproteobacteria的相对丰度增加而臭氧化OSPW样品中Gamma和Deltaproteobacteria的相对丰度下降。很明显，Deltaproteobacteria无法在原始和臭氧化OSPW的GAC生物膜上生长（图3A）。如前所述，这种不能生长可能是由于该组对GAC表面上发现的较高NA浓度的敏感性增加。

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图2

通过门分组的细菌群落成员的相对丰度。（A）原料OSPW; （B）臭氧化OSPW; （C）原料OSPW生物膜; （D）臭氧化的OSPW生物膜。

 

图3

原始和臭氧化浮游生物OSPW和GAC生物膜中不同Proteobacteria类（A）和Proteobacteria（B到D）的相对丰度。（B）Alphaproteobacteria命令; （C）Betaproteobacteria命令; （D）Gammaproteobacteria命令; （E）Deltaproteobacteria命令。

在其他门中，酸杆菌成员在北方森林泥炭地的碳水化合物降解中起着重要作用，因为这些微生物群在RNA衍生的序列库中很丰富，并且培养研究表明它们很好地适应酸性，营养物质 -条件恶劣（49）。Nitrospirae参与反硝化，硫氧化和硫酸盐还原，显示出它们适应不同地球化学条件和在局部生物地球化学循环中作用的相当大的能力（50）。先前已报道OSPW含有含氮和硫的杂原子化合物，这将支持Nitrospirae的存在（51）。绿弯菌门在碳水化合物和可溶性微生物产物的降解中发挥生态作用（52），因此在GAC生物膜处理过程中发挥重要作用，从GAC表面上吸附的细胞外聚合物（EPS）生物再生GAC。Bacteroidetes门的成员在许多海洋生态系统中都很丰富，并且已知在海洋领域中复杂有机底物（如多糖和蛋白质）的矿化中起关键作用（53）。Verrucomicrobia的自由生活，epibiotic和共生生活方式主要是异养并且可以导致高分子量碳水化合物（多糖）的降解，并且它们在不同淡水和海洋生境中的广泛发生表明这些细菌在水柱中发挥重要的生理生理和生物地球化学作用。以前，据报道，由于代谢副产物和细胞外聚合物在GAC表面积累，GAC的吸附能力可能会随着生物反应器的运行时间而降低（54）。因此，这些细菌的组合可以降解GAC表面吸附的EPS，并有助于GAC的再生以增加生物过滤器的寿命。

补充材料中的表S1显示了各种OSPW和生物膜样品的总体细菌多样性统计数据。Chao1（群落丰富度）和Shannon（群落多样性）指数证实GAC生物膜样品的丰富度和多样性均低于OSPW样品（见表S1）。这种降低的多样性可归因于在GAC表面上积累的NAs的毒性，这将允许仅对高浓度吸附的NA具有高耐受性的细菌存活。此外，臭氧化生物膜与原始OSPW GAC生物膜样品观察到的更高多样性（见表S1）有助于确认累积的NAs对GAC表面的影响，因为臭氧化OSPW的NA浓度比原始OSPW低得多（见“表”）。水质参数“下方”。原始和臭氧化的OSPW的细菌群落聚集在一起，而两个GAC生物膜群落也被分组。与其他样品相比，臭氧化OSPW中的GAC生物膜样品具有最大的遗传差异（距离），表明GAC吸附显着影响微生物群落的结构。

在所有四个样品的分类级别进一步鉴定了变形菌门（图3A）。该α-变形菌茁壮成长大相径庭的栖息地和发挥环境过程一个显著的作用。Alphaproteobacteria最主要的顺序是所有四个样本中的根瘤菌，占总丰度的45％至75％（图3B）。臭氧化降低了浮游生物OSPW中的根瘤菌组成，而它们仍然在生物膜样品中占主导地位。根瘤菌的成员通过在豆科植物（根部共生活具有不同的功能，包括大气固氮55，56）。Alphaproteobacteria的其他主要顺序是Rhodospirillales和Rhodobacterales（图3B）。红细菌的顺序包括光合细菌的种类，这种顺序的一些成员是化学有机营养物，可以代谢含硫有机化合物（56）。Rhodospirillales的成员是由所涉及碳水化合物和醇（的部分氧化光合，花-果形成种类和chemoorganotrophs的48，56）。OSPW含有硫 - 氮杂原子化合物（51），并且Rhodobacterales和Rhodospirillales的存在表明含硫和含氮化合物的代谢。在其他订单，成员Caulobacterales是chemoorganotrophs，而Sphingomonadales包括光养和chemoorganotrophic物种（48，56）。立克次氏体对人类和动物具有致病性（57）。

的β-变形菌是非常异质关于代谢，形态和生态学（48）和先前已被证明是在阿萨巴斯卡河，及其支流的沉积物中发现的沥青降解剂，和油砂尾矿池（46）。目前在这类细菌中观察到的主要顺序包括Rhodocyclales，Burkholderiales和Nitrosomadales（图3C）。原料OSPW（~40％）的主要顺序是Rhodocyclales，并且该顺序的组成从臭氧化和GAC生物膜样品（原始和臭氧化的OSPW）中降低。伯克氏菌目是臭氧化OSPW和生物膜样品的主导顺序（40％至70％）。Rhodocyclales的成员在废水处理系统中广泛且丰富，它们可以降解各种碳，包括脂肪族和芳香族化合物以及氮和磷（58）。据报道，伯克霍尔德菌（Burkholderiales）是芳香净化生物修复处理的微生物生态学的主要贡献者（59）。按此顺序排列的细菌可以降解多种芳香族化合物，包括多氯苯基，萘和菲（59）。因此，伯克霍尔德氏菌的增加臭氧化OSPW和生物膜样品中的组成表明生物膜中的微生物活性较高。Nitrosomonadales的细菌是化学营养生物，其氧化氨并从二氧化碳自养碳固定碳（60）。这些细菌可以适应低铵浓度，可以使用细菌代谢产生的二氧化碳（48）。

来自Gammaproteobacteria的命令对臭氧化敏感，并且在处理之间观察到组成的剧烈变化，如图3D所示。顺序假单胞菌（〜50％）是在原料OSPW显性组合物; 臭氧化OSPW的丰度降至~25％。Alteromonadales是臭氧化OSPW中最丰富的顺序; 在原始和臭氧化的OSPW GAC生物膜中，主要的顺序是Chromatiales（40％至48％）。其他主要指令是黄单胞菌，海洋螺旋藻，军团菌和甲基球菌（图3D））。由于臭氧化和生物膜形成的影响，所有四个样品中的组合物变化很大。间的订单，假单胞菌，Xanthomonadales，Alteromonadales，和海洋螺菌是多环芳烃（PAH）作用的降解，而Methylococcales是甲烷作用的降解（48，61）。Chromatiales命令的成员被称为光养紫色硫细菌，能够进行光合作用并在细胞中储存元素硫（62）。Legionellales是革兰氏阴性的化学有机营养病原菌，它在原生动物宿主（在氨基酸中作为碳和能源）在自然环境中存活，并且是肺炎和流感的原因（48）。

图3E示出了 δ-变形菌组合物，和主要命令是 Desulfuromonadales， Myxococcales，Desulfovibrionales， Desulfurellales，和 Bdellovibrionales。所述 Desulfovibrionales丰度分别为最高的原始和臭氧化的OSPW样品中，在45％和80％。该 Desulfuromonadales和 Myxococcales是最丰富的原料和臭氧GAC生物膜，分别。Myxococcales是需氧和碳作用的降解（ 63， - 65），而各成员Desulfuromonadales，Desulfovibrionales，和Desulfuromonas订单严格厌氧和硫酸盐/硫减速器（65，- 67）。Desulfurellales物种能够通过硫还原（氧化饱和脂肪酸66，68）。Bdellovibrionales成员是革兰氏阴性，运动和单鞭毛细菌，其特征在于捕食行为（或强制性寄生生命周期），其可以消化与人类感染相关的多药抗性病原菌（69）。蛭弧菌生物体通常生长在污染严重的生态位，如工业废水，河流和河口地区，它们可以独立地降解有机碳作为猎物（70）。