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【知识】阿霉素在聚甲基丙烯酸甲酯-壳聚糖-肝素涂层活性炭珠上的吸附

发布日期:2018-11-07 11:21 来源:活性炭网 作者:活性炭网 浏览数:

抽象 填充有活性炭珠(ACB)吸附剂的体外滤筒已被用于从血液中去除过量的癌症药物。 测试吸附剂基质上的涂层,聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)/活性炭珠和PMMA /壳聚糖/肝素/ ACB复合物

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介绍

强效抗癌剂的全身药物递送使整个身体暴露于这些药物的毒性水平。局部和靶向的化学治疗药物递送可以潜在地递送显着更高剂量的有毒抗癌药物,直接递送至需要它的肿瘤,降低全身毒性,并改善药物功效和安全性。最近已显示动脉内化疗导致显着的临床结果,与全身给药相比具有最小的副作用,因为肿瘤内肿瘤浓度较高。1 - 5增加的抗肿瘤作用通常被认为具有较高剂量强度相关,但也有严重的毒性相关联。6多柔比星(DOX)是一种化疗药物,用于治疗多种癌症,包括肝癌。然而,多柔比星具有显着的副作用,包括但不限于严重的心脏毒性,免疫系统的损害,急性恶心,严重的呕吐,皮肤病学问题和脱发。然而,DOX最严重的副作用是不可逆的心脏组织损伤。78活性滤芯已用于吸附有毒药物,将其从体内清除,特别是在过量使用的情况下。同样,我们设想活性碳滤筒可用于在将其输送到肿瘤部位(例如肝脏)后有效去除多余的DOX。这可以通过将肝脏与体循环分离,将DOX注入肝脏动脉,使用体外滤筒从门静脉排出多余药物,并将无血液DOX返回体内来实现。使用这种方法的主要挑战是目前可用的活性炭过滤器具有低的首过吸附能力,产生碳碎片,并激活血液凝固级联并破坏血细胞。从而,

我们之前曾报道,纤维素 - 肝素涂层的木炭能够吸附疏水性蛋白质结合的药物,而不会造成血液蛋白质的大量损失。910此涂覆纤维素肝素木炭依赖于涂覆工艺利用溶解于含纤维素的室温离子液体和需要大量的洗涤步骤的肝素咪唑鎓盐,以除去离子液体和转换肝素咪唑鎓盐进肝素钠盐。

在目前的研究中,PMMA是一种生物相容性聚合物,11已被涂在ACB表面,作为体外滤芯的潜在吸附剂。此外,还在这些涂层中加入肝素,通过化学共轭改善血液相容性(含有PMMA,壳聚糖12的多层涂层)和肝素钠)或物理混合(PMMA-肝素钠的一步混合涂层)。涂覆的ACB表面上的肝素含量通过电子分散X射线光谱法和X射线光电子能谱法测定。肝素在表面或ACB上的化学结合也具有潜在的优点,即肝素不会释放到培养基中,这避免了在溶液中形成肝素-DOX复合物。在水和磷酸盐缓冲盐水(PBS,10mM磷酸钠和0.138M氯化钠,pH7.4)中测试涂覆的和未涂覆的ACB对DOX的吸附。Freundlich模型用于研究吸附等温线。

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材料和方法

物料

聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA,分子量120kDa),盐酸多柔比星和高分子量壳聚糖(800cps,Aldrich#419419)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。所有溶剂均得自Fisher Scientific(Pittsburgh,PA)。来自猪肠的肝素钠盐(180U / mg)来自Celsus Laboratories(Cincinnati,OH,USA)。ACB获自乌克兰RE Kavetsky实验病理学,肿瘤学和放射生物学研究所的Vladimir G. Nikolaev博士。

ACB的表征

先前已经报道了ACB的堆积密度和表面特征。4使用光学显微镜测定当前批次的球形ACB的尺寸分布,以测量800个单独珠粒的直径。通过用剃刀刀片切割ACB制备的半球形珠粒成像来观察横截面形态。

用PMMA涂覆ACB

将干燥的ACB(100g)加入到PMMA的乙酸乙酯溶液(1200mL,2.5%w / v)中,并在2L烧杯中以145rpm摇动6小时。涂布后,倾析溶液,将珠粒在通风橱中的气流下干燥过夜,然后将它们在80℃的真空烘箱中进一步干燥。

用PMMA-肝素混合物层一步涂覆ACB

将肝素钠(50mg)溶于水(2.5mL)中,然后加入丙酮(7.5mL),得到澄清的0.5%(w / v)溶液。PMMA在丙酮中以5%(w / v)制备4mL,然后缓慢加入4mL肝素溶液中以避免沉淀,最终溶液稳定且灰白色。将分别重2g和1g的两批珠子(#1和#2)分别浸入16和8mL上述PMMA-肝素溶液中,并以180rpm摇动5小时。在各种不同条件下涂覆总共六批ACB。

用PMMA-壳聚糖涂覆ACB

将壳聚糖溶解在浓度为120mg / 16mL的0.25%(w / w)乙酸水溶液中。将干燥的PMMA涂覆的ACB(1.1g)加入到脱乙酰壳多糖溶液(8mL)中,并将所得混合物分三批摇动1小时,3小时和5小时。涂覆后,倾去上清液,用Bucher漏斗通过Millipore滤纸真空过滤珠子,用0.1N氢氧化钠溶液冲洗,再用水冲洗,除去残留的氢氧化钠。将PMMA-壳聚糖涂覆的珠粒在80℃的真空烘箱中干燥过夜。

在PMMA-壳聚糖涂覆的ACB上固定肝素

肝素的固定遵循文献略作修改。13简要地说,PMMA-壳聚糖包被的空气断路器(0.3g)的2-(中平衡Ñ吗啉代)乙磺酸(MES)-buffer(0.05M,pH为5.6)中1个小时。通过加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N来活化肝素溶液(5mL 2%(w / w)在0.05M MES缓冲液中,pH 5.60)。 - 羟基琥珀酰亚胺(NHS),EDC:NHS:肝素的摩尔比为0.4:0.24:1.0。预活化进行10分钟,然后加入0.3g缓冲液湿润的PMMA-壳聚糖ACB,并在室温下以180rpm摇动过夜。通过倾析回收珠子,然后用三次换水洗涤24小时。将肝素涂覆的珠粒在40℃的真空烘箱中干燥过夜。

阿霉素的吸附动力学

测试110mg部分的PMMA涂覆的ACB或PMMA-肝素一步涂覆的ACB在3mL体积的水中吸附0.6mg / mL DOX的能力。每3分钟从吸附小瓶中取出0.1mL等分试样,并加入2.5mL聚丙烯离心管中,用水调至0.9mL。将水(0.1mL)加入到吸附小瓶中以保持其体积。使用适当的稀释因子计算相应的浓度。将相对浓度计算为任何给定时间的浓度与初始浓度之间的比率。然后将相对浓度作为时间的函数作图。

在多层涂层中,使用与用于一步涂布的类似程序测试110mg部分的未涂布的,PMMA涂布的,PMMA-壳聚糖涂布的和PMMA-壳聚糖 - 肝素涂布的ACB。检查了两种不同的溶剂系统,水和PBS。

多柔比星溶液的校准曲线

通过测量水中的五种浓度0.05,0.025,0.0125,0.00625和0.003125mg / mL的480nm处的吸收最大值和600nm处的基线获得UV-Vis校准曲线。将这五个点拟合成线性曲线,R 2 = 0.996。将浓度高于0.05mg / mL的溶液稀释到校准曲线的范围内以进行测定。

吸附等温线

吸附等温线的测定在2.2mL聚丙烯离心瓶中的2mL多柔比星溶液中进行,每个样品具有10mg ACB。对未涂布的ACB,PMMA涂布的ACB和PMMA-壳聚糖 - 肝素涂布的ACB进行测定。在水和PBS中,初始浓度在0.0126-4mg / mL的范围内。将溶液在室温(22℃)下振荡(220rpm)12小时。绘制吸附容量(q)与平衡浓度(Ce)并将其拟合到Freundilich等温方程中。

活化的部分凝血活酶时间(aPTT)

将ACB或包被的ACB(250mg)与5mL人血(柠檬酸盐血液)在旋转器上温和混合30分钟。通过以1000× g离心10分钟分离血浆,并使用SynthASil试剂盒(Instrumentation Laboratory,Bedford,MA)在ACL8000自动凝固分析仪(Instrumentation Laboratory,Bedford,MA)上测定aPTT。结果是每种珠子的三次重复的平均值。本研究中使用的肝素的aPTT活性(浓度为0.1mg / ml)为107±3.0s(sd)。

表面形貌表征

使用JEOL JSM-6335 FE-SEM(Tachikawa,Tokyo,Japan)进行场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)以在10kV的加速电压下配备二次电子检测器来研究纤维的表面形态。在15毫米的工作距离。在进行FE-SEM分析之前,通过溅射用金涂覆纤维以形成导电层。

X射线光电子能谱(XPS)

使用半球形电子能量分析仪(HA100,VSW Ltd.,UK)和单色化Al X射线​​源在超高真空室中进行XPS实验。以45°的起飞角收集光谱。采集的测量光谱的通过能量为117.4 eV。使用C 1s峰的脂族组分校准结合能量标度为285.0eV。

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结果与讨论

有和没有涂层的ACB的物理特性表征

本研究中使用的ACB由热解球形树脂制备。4 ACB的大小分布如图1A所示ACB的平均直径为520±102μm(sd)。未涂布的ACB具有粗糙且多孔的表面,并且横截面图像显示通过纳米颗粒连接的基质(图1B)。表面和横截面的高孔隙率表明可能具有高吸附率。

 
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图1

(A)基于800个单独珠粒的未涂布ACB的尺寸分布,(B)未涂布ACB的SEM图像,左图像:表面,右图像:横截面,和(C)DOX的化学结构及其分子尺寸由ChemDraw确定3D。

在这项研究中,我们假设如果涂层没有显着改变孔径,具有多孔涂层的ACB将吸附DOX而凝结级联的活化最小。通过ChemDraw 3D(图1C测量,DOX具有0.79×1.45nm的分子尺寸未涂布和涂布的ACB的孔径,分布,表面积和总孔体积列于表1中,通过BET等温线测定。如我们所见,所有类型珠子的最常见孔径足够大(> 1.6nm)以吸附DOX分子。该PMMA表面积涂布后没有改变,和以下的权重调整,相对于未涂布的珠(2325米2/G); PMMA-壳聚糖和PMMA-壳聚糖 - 肝素涂层在重量调整后(分别为2040和1462 m 2 / g)显着下降,总孔容也相应减少,这可能影响吸附能力。

表格1

通过BET等温线涂覆和不涂覆ACB的物理性质。

ACB的类型 直径(mm) 表面积(m 2 / g) 孔容
(mL / g)
最常见的孔径
(nm)
非。 广告。 非。 广告。
未涂层的珠子 520±102 2325±31 2325±31 2.72±0.13 2.72±0.13 1.6和2.5-2.6
PMMA涂层珠 520±101 2070±26 2325±29 2.37±0.14 2.72±0.16 1.6和2.5-2.6
PMMA-壳聚糖涂覆的珠粒 520±102 1632±21 2040±27 1.88±0.11 2.35±0.14 1.8和2.5-2.6
PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子 520±102 1140±15 1462±19 1.47±0.11 1.88±0.14 1.6和2.5-2.6

平均值:平均值; 非:无调整; 广告:调整

DOX在一步涂覆的ACB上的吸附

我们最初尝试在ACBs表面涂覆PMMA /肝素混合物层是基于我们之前的工作,10和两种溶剂(水和丙酮)的组合被选择以一定比例溶解PMMA和肝素钠而没有沉淀。通过SEM-EDX获得肝素在涂覆珠粒上的表面分布; 然而,通过其他方式获得肝素在单位质量珠粒上的负载量。首先,将涂覆在ACB上的肝素用水提取过夜,然后通过咔唑测定一式三份测定上清液中肝素的量。14表2所示与批次#2相比,批次#1具有更高的肝素负荷。通过SEM-EDX分析(将获得的磺基含量转化为肝素含量)也一式三份证实了这种高肝素负荷。

表2

通过咔唑和EDX分析涂覆的ACB表面上的肝素含量。

涂层批次 咔唑mg肝素/ g珠 通过EDX在珠子表面上的%肝素
#1 1.9 +/- 0.2 7.0%+ / - 0.2%
#2 0.34 +/- 0.03 1.2%+ / - 0.1%
仅限PMMA 0 0

一步共混涂层的吸附动力学曲线如图2所示令人惊讶的是,与仅使用PMMA的ACB相比,在ACBs(批次#1,0.19%)上肝素负荷较高时,吸附率(0.25 mg•g -1 •min -1)和平衡吸附容量(8.2 mg•g )低得多-1)被观察到。这些减少也发现在较低的肝素负荷(批次#2,0.034%)中,意义较小。根据我们以前的工作,肝素涂层可能对ACB的孔径和表面积产生不利影响; 10它对药物的吸附没有如此显着的影响。考虑到混合物包被的肝素在水溶液中缓慢释放(PMMA不在水溶液中释放),游离肝素可能与吸附溶液中的DOX有一些相互作用。设计并执行对照实验以解决该问题。如果批次#1释放3 mL吸附溶液中的所有肝素含量,肝素浓度将为~0.07 mg•mL -1,因此在肝素浓度为0.5μg•mL -1和0.5 mg•mL时测试了两个对照吸附实验-1在水中。获得的吸附动力学曲线显示在图3中

 
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图2

用不同涂层吸附DOX在珠子上的动力学曲线(在水中进行吸附,初始浓度为0.6mg / mL)。

 
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图3

肝素浓度对吸附动力学的影响(DOX的初始浓度为0.6mg / mL)。

最初,三种条件下的吸附速率相似,但平衡吸附容量完全不同。在溶液中加入0.5 mg•mL -1肝素时,平衡吸附容量约为15 mg•g -1,与0.5μg•mL -1肝素和不含肝素的溶液相比,达到平衡需要更长的时间较低的肝素含量对平衡吸附能力几乎没有影响,18.2对19.2 mg•g -1(不含肝素)。

据报道,一个肝素分子可能在静电相互作用中与多达16个DOX分子复合,这种复合物降低了DOX的细胞毒性。15也报道肝素浓度对游离DOX在水溶液中的效应。16基于肝素(12000道尔顿)的平均分子量,肝素-DOX复合物的最大分子量可以被计算为20696道尔顿。如此大的大分子复合物无疑会降低一步混合涂覆的ACB的吸附速率和吸附容量。

在PMMA涂层上共价连接而不是混合肝素对于减少或消除游离肝素从涂层中的释放是必要的,从而提高吸附效率。不幸的是,PMMA没有可与肝素直接反应的官能团。将已建立的生物相容性基质壳聚糖17涂覆在PMMA上作为第二层,因为其可用的氨基团然后可以与肝素反应。

多层包覆ACBs的吸附动力学和溶剂效应

PBS溶液用于测量DOX的吸附以模拟人血液中的pH条件。18 PBS中还有望降低DOX和游离肝素之间的静电相互作用。

接下来在所有三种类型的涂层中在水和PBS中测量阿霉素吸附,而在水中仅测量未涂覆的珠粒(图4)。根据碳珠的重量分数调节吸附容量。所有具有或不具有涂层的珠子显示出初始快速吸附然后平衡。平衡时达到平衡和吸附容量的时间列于表3中

 
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图4

多组分包被珠的DOX吸附动力学(DOX的初始浓度为0.6mg / mL)。

表3

涂层类型和溶剂类型对吸附速率和吸附容量的影响。


涂料类型
未涂层的
珠子
PMMA 
涂层
PMMA- 
壳聚糖
涂覆的
珠粒
PMMA- 
壳聚糖 - 
肝素涂覆的
珠粒

溶剂类型

PBS中
达到
平衡的时间
(分钟)
N / A 18 三十 三十
平衡
容量
(mg / g)
N / A 19.6 17.1 18.2

水中
达到
平衡的时间
(分钟)
6 47 三十 三十
平衡
容量
(mg / g)
16.1 19.1 17.5 18.1

与所有三种类型的涂层相比,未涂覆的珠粒在水中达到平衡最快; 然而,它的平衡吸附能力最低。这可以解释为因为它仍然太远以至于未涂覆的珠粒达到饱和,并且与涂覆的珠粒相比使用较低部分的总可用吸附位点。PMMA-壳聚糖涂覆的和PMMA-壳聚糖 - 肝素涂覆的珠子在水和PBS中显示出相似的吸附行为,并且在水和PBS中均达到平衡所花费的时间几乎相同。PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子在平衡时的吸附容量略高于PMMA-壳聚糖包被的珠子,这可能归因于在PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子的表面上形成肝素-DOX复合物。就PMMA涂层珠子而言,所用溶剂的类型对吸附速率有显着影响,但对平衡吸附容量没有影响。我们可以看到,这些珠子在PBS中很快达到平衡(18分钟); 然而他们花了47分钟在水中达到平衡。由于PMMA涂覆的珠粒具有疏水表面,其可以排斥亲水性药物,因此可以防止DOX快速穿过涂层并到达珠粒深处的吸附位点。带负电荷的磷酸根离子可以结合2-3个DOX盐酸盐分子,并允许药物的亲水部分保持在一起并且药物的疏水部分留在外面。因此,DOX将快速通过疏水涂层并到达珠子的吸附位点并被吸附。

DOX在多层涂覆的ACB上的吸附等温线

吸附等温线研究了平衡吸附容量与相同温度下的平衡浓度之间的关系。水和PBS均用于获得最大平衡吸附容量,最高达4 mg / mL DOX。然而,发现在PBS中非常高的DOX浓度下,未涂覆的珠子促进了DOX的沉淀并导致上清液中DOX浓度的不正确。因此,目前的研究中没有提出PBS中DOX的吸附等温线数据。两种模型通常用于吸附研究,Langmuir等温线和Freundlich等温线。Langmuir等温线对于具有有限数量的相同位点的表面上的单层吸附是有效的,因此它不适用于自R 2以来的当前研究值小于90%。基于具有不同亲和力的ACB的异质表面,Freundlich等温线可能更好地描述当前吸附。其公式如下:19

Ig q = Ig K F +(1 / n)Ig C e
(1)

其中q是每单位质量珠子吸附的多柔比星(mg)的量(g),C e是平衡浓度(μg/ mL),K F和n是与1μg平衡浓度下吸附容量相关的Freundlich常数/ mL和吸附剂的吸附强度。

拟合曲线示于图5AND6,6,和符合Freundlich常数和R 2中列出。表4AND55分别对水和PBS。发现与水中的那些相比,PMMA包衣和PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子在PBS中具有显着更高的K F值和n值。虽然由于表面积的差异很大,PMMA涂层珠子的PBS中的K F值远高于PMMA-壳聚糖 - 肝素涂覆的珠子,但是在K F中对K F的反应效果相反。由于PMMA涂层的疏水性较高,观察到了该值。这些观察结果证实了涂层的疏水性和溶剂类型对吸附能力的影响。

 
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图5

在具有不同水包衣的珠子上的吸附等温线(左)和线性拟合(右)。(对于所有类型的珠子,在2 mL溶液中~10 mg,平衡时间:12 h)

 
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图6

在PBS上具有不同涂层的珠子上的吸附等温线(左)和线性拟合(右)。(对于所有类型的珠子,在2 mL溶液中~10 mg,平衡时间:12 h)

表4

Freundilich等温模型常数和相关系数,用于在25℃水中有和没有涂层的珠子上吸附DOX。

KF ñ 2
未涂布 6.4 1.5 0.95
PMMA涂层 3.3 1.7 0.98
PMMA-壳聚糖 - 肝素涂层 8.5 2 0.97

表5

Freundilich等温模型常数和相关系数,用于在25℃下在PBS中有和没有涂覆的珠子上吸附DOX。

KF ñ 2
PMMA涂层 37 2.4 0.91
PMMA-壳聚糖 - 肝素涂层 24 2.4 0.94

ACB与不同涂层的血液相容性

进行活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT),血液相容性的指示,以测量PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子以及人血浆中的其他包被的珠子的抗凝血活性(图7)。发现PMMA和PMMA-壳聚糖涂覆的珠子显示出与未涂覆的珠子(32-35秒)相似的aPTT值; 然而,PMMA-壳聚糖 - 肝素涂层珠子显示出比其他涂层珠子显着更高的aPTT值(192±31 s),这几乎是0.1 mg / mL对照肝素的两倍,并进一步证实了表面上的共价键合肝素。 PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子没有丧失抗凝血活性。

 
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图7

aPTT产生四种不同类型的珠子和没有珠子的对照。

不同涂层的ACB表面形貌

通过FESEM获得具有和不具有涂层的珠粒的表面形态(图8)。未涂覆珠粒的表面具有粗糙且高度多孔的结构,具有微米和亚微米孔径。内部珠粒结构由在珠子的横截面中看到的亚微米粒子的聚集组成(图2, 对)。表面显示出比未涂覆的珠粒更光滑,在涂覆PMMA后珠粒表面上有大量可用的亚微米级孔。PMMA-壳聚糖珠粒比未涂布或PMMA涂布的珠粒更光滑。与PMMA-壳聚糖涂覆的珠粒相比,PMMA-壳聚糖 - 肝素涂覆的珠粒具有相对粗糙的表面,并且显示出大量可用的纳米尺寸的孔用于吸附DOX。通过XPS进行的表面元素分析(图9)显示来自磺基和酯基的信号(碳信号),证实在PMMA-壳聚糖层上存在固定的肝素。

 
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图8

FESEM图像(a)未涂覆的珠粒,(b)PMMA涂覆的珠粒,(c)PMMA-壳聚糖涂覆的珠粒,(d)PMMA-壳聚糖 - 肝素涂覆的珠粒。左侧面板具有低放大率,右侧面板具有高放大率。

 
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图9

在PMMA-壳聚糖 - 肝素包被的珠子上的XPS,左侧C1s信号右侧S2p信号。

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结论

制备PMMA涂覆的ACB和PMMA-壳聚糖 - 肝素涂覆的ACB以改善这些载体的生物相容性和血液相容性。PMMA-肝素的一步混合涂层也在丙酮 - 水共溶剂中进行。增加PMMA-肝素包被的珠子上的肝素负荷显着降低了吸附速率和平衡吸附能力。由PMMA,壳聚糖和共价缀合的肝素组成的三层涂层用于减少肝素从涂层中的释放。吸附动力学表明,溶剂(水和PBS)对PMMA-壳聚糖和PMMA-壳聚糖 - 肝素包覆珠粒的吸附速率和平衡吸附容量影响不大,但对PMMA包覆珠粒的吸附速率有显着影响。

使用系统药物去除系统的医生非常关心的是在手术过程中看到碳碎片离开过滤器,因为这些碳碎片可能滞留在肺的小动脉和毛细血管中并模仿肺栓塞。先前在临床试验中使用的过滤器表现出低的首过吸附能力,产生的碳碎片,并激活血液凝固级联。目前的吸附系统应该缓解这些问题,并且可能在去除高剂量区域化疗药物的同时发现潜在的应用,同时保持高效率,生物相容性和血液相容性。


(责任编辑:活性炭网)
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