胰蛋白酶消化

使用在50mM碳酸氢铵缓冲液中制备的6M盐酸胍和10mM DTT，将模型糖蛋白（2.0-5.0μg）同时变性并在50℃下还原1小时。然后使糖蛋白样品冷却至室温，然后加入碘乙酰胺至终浓度为25mM。将还原的半胱氨酸残基在室温下在黑暗中烷基化1小时。通过添加50mM碳酸氢铵缓冲液将最终消化体积调节至300μl。以1:30质量的胰蛋白酶与蛋白质的比例添加胰蛋白酶。使消化在37℃下进行18小时。通过将所得肽溶液的pH调节至约10℃来淬灭消化反应。3，使用甲酸。

再现性和可重复性

使用两种糖肽检测活化的石墨化碳固定相用于胰蛋白酶糖蛋白分析的再现性和可重复性：来自牛核糖核酸酶B 的Man 5 -SRNLTK糖肽和来自辣根过氧化物酶的GlcNAc 2（Fuc）Man 3（Xyl）-NVGLNR 。结果如图1a和1b所示对于核糖核酸酶B衍生的糖肽和辣根过氧化物酶衍生的糖肽，分别如此。对每种糖肽进行10次每次分析。对于核糖核酸酶B，所有分析均以单一序列进行，每次注射使用500-fmol等份的胰蛋白酶消化物。辣根过氧化物酶分析在两天内以两个序列进行，以监测芯片的日常重现性和可重复性。该糖肽的每个序列由5次分析组成，每次注射使用500fmol的胰蛋白酶消化。

 

图1

提取离子色谱图描绘了活化石墨化碳的保留时间重现性和重复性，用于（a）源自牛核糖核酸酶B的胰蛋白酶消化的糖肽SRNLTK-GlcNAc 2 Man 5，和（b）糖肽NVGLNR-GlcNAc 2（Fuc） Man 3（Xyl）衍生自辣根过氧化物酶的胰蛋白酶消化。核糖核酸酶B胰蛋白酶消化物（500fmol）在一天内注射10次，而辣根过氧化物酶胰蛋白酶消化物（500fmol）在两天内注射10次（每天5次注射）。

对于核糖核酸酶B糖肽的10次分析，平均保留时间为19.2分钟±0.1分钟（图1a）。最短保留时间为19.1分钟，而最长保留时间为19.4分钟（2次分析）。这些结果表明活化的石墨化碳的注射 - 注射重复性是优异的。我们还检查了两天注射到注射的可重复性。使用辣根过氧化物酶的胰蛋白酶消化物评估了这一点。在这种情况下，在两天内进行10次注射（每天5次注射）。第一天达到的平均保留时间为12.1分钟±0.1分钟（图1b）。最短保留时间为12.0分钟，而最长保留时间为12.3分钟。第二天的注射也是非常可重复的，平均保留时间为11.8分钟±0.1分钟。此处，最短保留时间为11.6分钟，最长保留时间为11.9分钟。然而，两天之间的平均保留时间有半分钟的变化，这可能归因于温度波动。在活化的石墨化碳介质上获得的分离似乎是高度依赖于温度的。然而，考虑到所有10次注射，两天内的平均保留时间为11.8min±0.1min。因此，注射 - 注射保留时间重复性不仅看起来很好，而且日常再现性也很好。

确定活化的石墨化碳芯片的注射 - 注入残留非常低，而同一芯片的回收效率非常高。这些是从图1所示的提取离子色谱图强度的高重复性推断出来的。对于衍生自核糖核酸酶B的糖肽，平均强度为（6.5±0.4）×10 7计数，由提取离子色谱图的积分确定。最低观察值为5.9×10 7计数，而最高值为7.1×10 7计数。基于提取离子色谱图，第一序列的辣根过氧化物酶糖肽的平均强度为（3.5±0.3）×10 7计数。

牛核糖核酸酶B的分析

核糖核酸酶B是一种糖蛋白，在N 60具有单个N-糖基化位点，具有5个高甘露糖聚糖结构（GlcNAc 2Man 5-9）。胰蛋白酶消化该蛋白质产生小的亲水性糖肽，其具有SRNLTK的氨基酸序列（1个错过的切割）。因为其亲水性的，这糖肽没有通过C被困18芯片，并冲出的废线（数据未示出）。然而，当使用活化的石墨化碳芯片进行分析时，检测到肽骨架的所有5种糖形式（图2）。有趣的是，Man 5糖肽保留最多。男人6糖肽是第二保留的，并且与Man 5糖肽很好地分离。剩余的三种糖肽没有很好地分辨，但在Man 6糖肽之前洗脱。（参见图2）。核糖核酸酶B糖肽的这种洗脱顺序与先前公布的数据8一致，其中具有N或NL氨基酸序列的链霉蛋白酶核糖核酸酶B糖肽在4.6×100mm Hypercarb柱上分离。这项工作表明，聚糖结构和肽骨架都与活化的石墨化碳固定相相互作用。据报道，GlcNAc 2 -Man 6 -N在GlcNAc 2 -Man 5之前洗脱在GlcNAc 2 -Man 5 -NL 之前洗脱-N和GlcNAc 2 -Man 6 -NL。两种氨基酸 - 肽保留得更强。据报道只有Man 5和Man 6糖肽，这两种糖肽最丰富; 尽管如此，报告的洗脱顺序与此处观察到的洗脱顺序一致。洗脱曲线如图2所示表明所示的分离是聚糖部分与活化的石墨化碳固定相之间亲水相互作用的结果。此外，结果还表明肽骨架基本上不参与相互作用，因为分离主要基于与肽骨架连接的聚糖部分的大小。

 

图2

来自牛核糖核酸酶B的胰蛋白酶消化的糖肽的提取离子色谱图，并使用活化的石墨化碳芯片进行分析。插图，Man 5附着的糖肽的CID光谱。

核糖核酸酶B糖肽的碰撞诱导解离提供了足以证实糖肽特性的信息。图2的插图描绘了三质子化的Man 5糖肽的CID光谱。在串联质谱中存在几种诊断离子，因此证实了Man 5糖肽的特性。电喷雾电离产生三重和双质子化离子，其m / z值分别为645.9和968.0。在CID光谱中，产物离子为m / z204.5是对应于GlcNAc残基的聚糖氧鎓离子。所有5个甘露糖残基的丢失，仅留下与肽骨架连接的核心2GlcNAc残基，由m / z 375.9 处的三重质子化产物离子证明。m / z值为429.2,483.7,537.7和591.7 的三重质子化离子系列均被54分开，分别对应于4,3,2或1个甘露糖残基的连续损失。在m / z 464.4 处观察到仅具有单个GlcNAc残基的肽骨架作为双质子化产物离子。在CID光谱中也观察到m / z值为724.9,806.3和886.4 的双质子化产物离子系列。每个离子间隔81 米/z单位。这些离子分别由3个，2个或1个甘露糖残基的损失产生。m / z 921.6 处的单质子化产物离子是与GlcNAc残基连接的肽骨架的离子。对于Man 6-9糖肽也观察到类似的CID数据（数据未显示），因此允许鉴定图2中所示的糖肽。

辣根过氧化物酶的分析

辣根过氧化物酶是具有8个糖基化位点的糖蛋白。据报道，与该蛋白质相关的主要聚糖是GlcNAc 2（Fuc）Man 3（Xyl），相对于其他已知的聚糖结构存在70％的丰度。22

对活化的石墨化碳芯片上的辣根过氧化物酶胰蛋白酶消化物的分析导致成功鉴定了来自4个糖肽的8个糖基化位点中的5个。其中一种鉴定的糖肽含有两个糖基化位点。的C 18芯片只能够保持单一的糖肽，其也与活化的石墨化碳芯片观察除了其他3个糖肽。在使用活化的石墨化碳鉴定的糖肽中，我们能够通过CID确认仅一种的同一性，而其他的导致差的CID数据。因此，这里使用ETD来验证这些糖肽的氨基酸序列。

使用活化的石墨化碳芯片的GlcNAc 2（Fuc）Man 3（Xyl）聚糖结构的糖肽NVGLNR的提取离子色谱图如图3所示。该糖肽具有非常短的肽骨架（6个氨基酸）并且非常亲水。相关的聚糖只能增加糖肽的总体亲水性。因此，该糖肽被有效活化的石墨化碳芯片（保留图3），但是没有被下保温18（未示出数据）芯片。

 

图3

从辣根过氧化物酶衍生的胰蛋白酶糖肽NVGLNR-GlcNAc 2（Fuc）Man 3（Xyl）的提取离子色谱图，并用活化的石墨化碳芯片分析。插图，糖肽的CID光谱。

对于m / z值922.1（理论m / z为922.4）获得的该糖肽的CID光谱在图3的插图中描绘。m / z 366.1 处的产物离子表示对应于GlcNAc-Man的聚糖氧鎓离子，而m / z值为528.2和690.2的产物离子分别代表GlcNAc-Man 2和GlcNAc-Man 3结构。m / z 822.3 处的离子代表GlcNAc-Man 3 -Xyl，而m / z值为539.7,620.9,701.9和782.9 的一系列双质子化离子对应于具有GlcNAc 2的肽。核心，以及分别顺序添加1,2或3个甘露糖残基。m / z 767.5 处的离子代表岩藻糖和1甘露糖单元的损失。存在于m / z 848.3 的离子是由来自糖肽的核心岩藻糖的损失引起的。在m / z 1078.6 处观察到的产物离子源自保留核心GlcNAc残基的肽骨架，而在m / z 875.5 处的产物离子表示具有单个GlcNAc残基的肽骨架。来自肽骨架的碳水化合物结构的完全损失在CID光谱中由在m / z处观察到的产物离子表示672.3。基于芯片的分析产生的CID光谱与先前公布的使用传统纳米LC柱和纳米喷雾源分析的相同糖肽的结果几乎相同。22 - 24

仅使用活化的石墨化碳固定相观察到另外两种辣根过氧化物酶糖肽。图4说明了双核糖基化的糖肽（LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR）的提取离子色谱图，其中GlcNAc 2（Xyl）Man 3（Fuc）聚糖结构在N 216和N 228处连接。这种糖肽的保留时间是...49分钟，仅在85％流动相B洗涤期间从柱中洗脱。这种特殊的糖肽产生了难以解释的CID谱，很可能是由于其两个糖基化位点。该肽上存在两个聚糖结构可能导致复杂的片段化途径，产生难以解释的谱（数据未显示）。观察到的该糖肽的m / z值为1274.1，而理论值为1274.3。为了验证该糖肽的氨基酸序列，使用ETD。该糖肽的ETD串联MS谱产生一系列z 。来自z的离子。4-8。一系列的C”的离子也从C本' 3-8和c' 10。由于在该肽的第九位存在脯氨酸，未观察到c'9离子。存在足够的信息以准确推断出该肽的氨基酸序列。由于M / Z的C”的3离子，1579.5，第一个糖基化位被确定。不幸的是，仅这一数据不允许确定该肽的第二糖基化位点。为了明确地定位与该糖肽相关的第二个位点，z 。必须识别9离子，在这种情况下不是。

 

图4

辣根过氧化物酶胰蛋白酶胰蛋白酶LYNFSNTGLPDPTLNTTYLQTLR的提取离子色谱图，其中附着有GlcNAc 2（Fuc）Man 3（Xyl）聚糖结构。插图，糖肽的ETD串联质谱。

在被激活的石墨化碳分析（观察到的第二糖肽图5a）和不是在C 18（图5b）具有其中的GlcNAc LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR的氨基酸序列2（Fuc的）曼3（的Xyl）聚糖结构附接。该糖肽不产生信息性CID或ETD光谱。因此，使用精确质量来鉴定该糖肽。观察到的该糖肽的m / z值为1299.9，而理论值为1300.2。观察到的和理论m / z值之间的变化在这里使用的质量精度内。

 

图5

胰蛋白酶的糖肽的提取离子色谱图LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR-GlcNAc的2（Fuc的）曼3（的Xyl）从辣根过氧化物酶衍生和分析使用活化的石墨化碳的（a）和C 18（b）中的芯片。通过精确质量匹配鉴定该肽。

牛胎球蛋白的分析

牛胎球蛋白是具有3个N-糖基化位点的糖蛋白。胰蛋白酶消化产生具有15,28和32个氨基酸的大糖肽。与这些糖基化位点相关的聚糖是复合型单 - ，二 - ，三 - 和四唾液酸化的。当将500fmol的胰蛋白酶消化物注射到活化的石墨化碳芯片上时，未检测到任何糖肽（数据未显示）。这些大的糖肽显然太疏水而不能从活化的石墨化碳固定相中有效地洗脱。只有当C 18芯片采用，检测到N-糖基化的位点3和4点O-糖基化的（图6）。观察到具有不同微观异质性的糖肽，导致鉴定出16种不同的糖肽。此外，这些胎球蛋白糖肽的CID光谱证实了糖基化（参见图6的插图）。m / z 1470.1 处的糖肽具有与VVHAVEVALATFNAESNGSYLQLVEISR氨基酸序列相关的三唾液酸化三触角聚糖结构。对于该糖肽，m / z 657.3 处的产物离子是对应于GlcNAc-Gal-NeuNac残基的常见氧鎓离子。该氧鎓离子的损失产生在m / z 1741.5 处观察到的三重质子化产物离子。一个天线和一个额外的唾液酸的损失导致形成具有m / z的三重质子化产物离子价值1644.4。两个天线的损失导致在m / z 1522.2 处检测到三质子化离子。最后，当天线，唾液酸残基和甘露糖残基丢失时，观察到m / z值为1590.4 的三重质子化离子。

 

图6

胰蛋白酶的糖肽的提取离子色谱图GLIQSDQELFSSPNATDTIPLVR-GlcNAc的2（Fuc的）曼3（的Xyl）从辣根过氧化物酶衍生的和用C分析18芯片。插图，糖肽的CID光谱。

据此前报道，从胎球蛋白的胰蛋白酶消化糖肽原可以在激活的石墨化碳，分开7，但这些糖肽拥有错过了分裂。使用该出版物中描述的方法，计算此处分析的所有糖肽的疏水性/亲水性指数（表1）。根据疏水性/亲水性指数，具有更多负值的肽更具疏水性，而具有更多正值的肽更具亲水性或更少疏水性。疏水性/亲水性指数仅考虑肽骨架，并且不考虑聚糖部分归因于什么。

当比较辣根过氧化物酶和胎球蛋白的疏水性/亲水性指数值时，使用活化石墨碎片分离的辣根过氧化物酶的三个糖肽骨架具有比胎球蛋白糖肽更低的疏水性/亲水性指数值（-232，-102和-83）。具有RPTGEVYDIEIDTLETTCHVLDPTPLANCSVR的肽序列（疏水性/亲水性指数值为-55）。根据这种疏水性/亲水性指数，胎球蛋白衍生的糖肽应该在活化的石墨化碳芯片上分离。然而，使用活化的石墨化碳芯片未检测到该糖肽。因此，我们认为与肽连接的聚糖归因于糖肽在固定相上的保留。辣根过氧化物酶仅具有小的非唾液酸化结构，而更大的唾液酸化聚糖与胎球蛋白骨架连接。在我们的流动相条件下（0.1％甲酸，戴维斯等。使用不与ESI相容的0.1三氟乙酸），唾液酸的羧酸酯基团不具有任何电荷，因此它们的总疏水性将增加。反相C 18证明了这一点色谱法，其中相同的糖肽将根据与其聚糖相关的唾液酸基团的数量洗脱; 具有单唾液酸化聚糖的糖肽将在具有二唾液酸化聚糖的糖肽之前洗脱，该聚糖将在具有三唾液酸化聚糖的糖肽之前洗脱。（数据未显示。）因此，我们认为唾液酸基团的存在显着促进了糖肽在此处使用的酸性条件下的疏水性，从而防止胎儿糖肽在本工作中使用的LC条件下从活化的石墨化碳芯片中洗脱。

迄今为止，从这些模型的糖蛋白，在汇总的结果表1，表明具有短的肽主链（6个氨基酸长）的糖肽是公由活化的石墨化碳芯片保留，但不能被C 18。而且，随着适度长的肽主链（23-24个氨基酸，不同之处有14个氨基酸长的胎球蛋白糖肽衍生当一个C这是仅检测到糖肽18是采用固定相）也由活化的石墨化碳芯片观察到，但也可以由C 18保留。然而，具有长肽骨架（28-32个氨基酸长）和唾液酸化聚糖结构的糖肽未被活化的石墨化碳鉴定，并且只能使用C检测和鉴定。18芯片。这表明实现了复杂的糖肽样品，两个分析应利用两种不同介质（活化的石墨化碳和C进行的综合分析18），从而允许亲水性和疏水性的糖肽的保留。