介绍

结肠直肠癌（CRC）是美国男性和女性癌症相关死亡的主要原因之一，根据美国癌症协会的统计数据，2012年估计有143 460例新病例和51 690例死亡[ 1 ]。准确的淋巴结转移分期对CRC患者具有预后和治疗重要性。先前的研究已经发现，评估淋巴结的数目手术切除后呈正CRC患者的存活相关[ 2，3 ]。然而，基于人群的数据表明，淋巴结评价不是在多数患者CRC [充分4，5 ]。此外，计算机断层扫描（CT）[ 6甚至正电子发射断层扫描[ 7 ]，在识别淋巴结状态方面也不够有效。因此，已经应用了多种技术，包括淋巴结染色或放射性核素扫描[ 8 ]，以使淋巴结检索更有效。

纳米颗粒的生物应用是纳米技术[一个快速发展的领域9，10 ]。已经观察到颗粒通过淋巴管而不是毛细血管，这主要是由于渗透性的差异。活性炭纳米颗粒悬浮液（ACNS），使用直径为21nm的光滑碳颗粒添加悬浮剂，是直径为150nm的碳颗粒的稳定悬浮液。ACNS显然倾向于淋巴系统。在巨噬细胞吞噬作用后，ACNS迅速聚集在淋巴结中并将它们染成黑色。这种独特的选择性生物分布被广泛地研究，近年来，如前哨淋巴结染色，药物载体和热疗[ 11 - 13 ]。

在我们之前的研究[ 14 ]中，将62例CRC患者分为两组。实验组使用简单的淋巴染色方法，在体外切除标本后立即将亚甲蓝（MB）注射到区域主要血管中。可以检测到更多和更小的淋巴结，这显着改善了切除的结肠直肠标本的淋巴结收获。然而，淋巴结转移的检测灵敏度低，并且不能在体内进行染色在淋巴结构破坏之前。因此，我们进行了一项随机对照试验，以测试MB和ACNS作为示踪剂是否可以增加CRC切除后系统淋巴结切除组织中检测到的淋巴结数量，并比较两种方法的染色效果，以便选择最佳的一种方法。进一步临床应用。

材料和方法

手术技术

所有外科手术均由同一外科医生团队完成。每位患者在手术前30分钟内给予2g头孢菌素进行抗生素预防，如果手术持续时间超过2小时，则重复相同剂量。

在A组中，患者接受1毫升ACNS（渝莱美制药有限公司渝，中国）的浆膜下注射在4象限区的质量（图周围（Figure1A）。图1A）。为了避免沿支气管和血管对淋巴系统进行手术破坏，我们在注射后等待10分钟。B组中，MB采用相同的方法注射（江苏省泰兴市江苏省跳跃药物集团），但染色效果非常差，部分原因是MB 在体内迅速吸收，然后随尿液排出。因此，我们建立了体外淋巴结染色的方法。将试样解剖后，我们立即识别试样的大动脉和分离它在根为1厘米，并注入2毫升MB慢慢进入分离，拉伸和固定容器（图（Figure2A）。图2A）。注射后我们也等了10分钟。在C组中，ACNS和MB均未用于染色。

 

图1

体内活化的碳纳米颗粒悬浮液作为结肠直肠癌淋巴结检测中的示踪剂是有效的。A：将活性炭纳米颗粒悬浮液（ACNS）浆膜下注射到肿块周围的四象限区域; B：可以从肠系膜脂肪组织中轻易识别淋巴结，箭头指向黑色染色的淋巴结; C：ACNS迁移至淋巴结（苏木精和曙红，×100）。

图2

体外亚甲蓝用作结直肠癌淋巴结检测的示踪剂。A：分离标本的主动脉，并将亚甲蓝（MB）注入容器中。可以很容易地识别淋巴结，箭头指向蓝色淋巴结; B：MB迁移至淋巴结（苏木精和曙红，×100）。

通过视觉检查和触摸脂肪组织，系统地分离和除去所有肠系膜淋巴结。在识别和切除后，收集所有黑色或蓝色节点用于随后的病理检查。静脉注射阿片类药物可缓解术后疼痛。

结果

检测到淋巴结

检测到的淋巴结总数分别为535,476和223。A组患者淋巴结检出平均数明显高于C组（26.8±8.4 vs12.2±3.2，P <0.001）。同样，B组检测到的淋巴结明显多于C组（23.8±6.9 vs 12.2±3.2，P<0.001）。然而，有A组和B组（26.8±8.4之间没有显著差异VS 23.8±6.9，P > 0.1）（图（Figure3A）。图3A）。A组13例，B组10例，C组11例，切除50,46和32个转移淋巴结，三组间差异无统计学意义（P > 0.1）。根据AJCC指南，准确的临床分期需要超过12个检测到的淋巴结。在这项研究中，60名患者中有11名患者的淋巴结数量不足。其中，仅一个与T B组患者4A直肠癌有检测10个淋巴结，其它10名患者均从C组（P<0.001）。根据不同的直径范围，检测到的淋巴结（LN）分为三类：LNs≤2mm，2 mm <LNs≤5mm，LNs> 5 mm。我们分析了各组检测到的淋巴结和转移淋巴结的不同直径类别，发现A组和B组的淋巴结检出数明显高于C组。但组间差异无统计学意义。 A和B组的数据被显示在图Figure3B。3B。各组间转移淋巴结无明显差异（P > 0.05）。同样，肿瘤位置，T分期和肿瘤分化对染色结果没有影响（P < 0.05> 0.05）。肠系膜肥大可能通过不同的染色方法影响淋巴结检测[ 15 ]。探索肠系膜肥大是否影响在我们的试验中染色结果，患者在两个染色组分别根据亚身体质量指数（BMI）的标准作为BMI≤重新分类23公斤/米2，23公斤/米2 < BMI≤25kg / m 2，BMI> 25 kg / m 2。统计分析表明，BMI在两个不同的染色方法是次要的影响因素，而肠系膜肥大不影响染色结果（图（图4）。4）。使用任ACNS（图（Figure1B）1B）或MB（图（Figure2A），2A），染色的淋巴结可以容易地从肠系膜脂肪组织可视化，并与未染色的组（比较染色时间为淋巴结没有显著不同P > 0.05）。苏木精和曙红染色显微照片证实，ACNS迁移至淋巴结（图（Figure1C），1C），因此确实将MB（图（Figure2B）。2B）。注射ACNS或MB的患者均未发生与药物相关的并发症。

 

图3

在三组中检测到淋巴结。答：检测到的淋巴结平均数; B：淋巴结直径的分布。一个P <0.05，b P <0.01 VS组A. LN：淋巴结。

图4

体重指数作为两种不同染色方法的影响因素。LN：淋巴结; BMI：体重指数。

讨论

结直肠癌的淋巴结状态在肿瘤分期，分类，术后序贯治疗和预后中起重要作用。检测到的淋巴结数量是结肠癌患者的重要预后因素[ 16 ]。AJCC和美国病理学家学院建议检测至少12个淋巴结，以便更准确地诊断II期CRC [ 17 ]。然而，最近的研究表明CRC的淋巴结检出率仍然较低[ 4 ]，这不能准确反映患者的病情。影响淋巴结检测的因素很多，包括患者的年龄，性别，肿瘤分级，手术切除范围和病理学家的专业知识[ 18]]。触诊仍然是淋巴结检测的最重要方法[ 19 ]。已经进行了大量研究以改进淋巴结检测方法。Cawthorn等[ 20 ]使用二甲苯醇清除技术来促进淋巴结的鉴定（23.1±1.18 vs 10.5±0.6）。Quadros等[ 21使用锝-99 m-phytate和专利蓝进行淋巴闪烁扫描，检测直肠腺癌患者的淋巴结，显着提高淋巴结检出率，尤其是侧盆腔淋巴结转移。然而，这些技术在临床实践中并未广泛使用，因为它们耗时，劳动强度大且对医生有毒。该临床试验在体内或体外使用新型纳米材料ACNS和MB 。结果表明，与常规触诊方法相比，两种染色技术均可显着改善淋巴结检测（26.8±8.4 vs 23.8±6.9 vs12.2±3.2）。在我们的研究中，没有患者在ACNS染色组中检测到的淋巴结数量不足，MB染色组中仅有1例，而未染色组中有10例患者。统计结果显示在不同直径类别中，所检测到的淋巴结在两种两个染色组比未染色的组显著更高（图（图4），4），特别是在ACNS小组。这证明了两种染色方法在检测较小直径淋巴结中的明显优势。微转移定义为肿瘤细胞的粘连沉积物为2mm或更小，但大于0.2mm。该定义已在AJCC第7版中进行了扩展，包括> 200个细胞的非粘性浸润作为微转移[ 22]。没有明确的结论已经得出关于前哨淋巴结活检及微转移对CRC [预后的作用23，24]。考虑到本研究中淋巴结微转移检测的优势，我们的团队将进一步研究前哨淋巴结活检和微转移对CRC患者预后的影响。在该试验中，我们未发现两种染色方法之间在检测到的淋巴结总数，淋巴结直径或淋巴结转移方面的显着差异，这可能归因于样本量的限制。

纳米颗粒的生物应用的是纳米技术的快速发展的领域，在诊断[提出了新的可能性，25 ]和治疗人类癌症[的26，27 ]。正在开发纳米粒子用于T1加权磁共振成像[ 28 ]，放射性核素用于单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描[ 29 ]，碘用于CT [ 30 ]和含气体气泡用于超声检查[ 31 ]。几个纳米技术已被用于改善对癌细胞[递送化疗剂的32，33 ]，促进了微剂量临床研究[34 ]。Schroeder等[ 35 ]的综述表明，纳米颗粒治疗将改善转移性癌症患者的预后。使用ACNS结合术前淋巴闪烁扫描和术中伽玛探针检测，乳腺癌患者内乳前哨淋巴结活检的检出灵敏度为100％[ 36 ]。他的一项临床试验[ 37 ]表明，ACNS和MB均可作为非小细胞肺癌淋巴结检测的示踪剂。然而，结肠直肠癌淋巴结检测中的ACNS染色仍然很大程度上尚未开发。然而，当MB用于体内 CRC的淋巴结染色时，MB被广泛用于临床实践中它在淋巴结检测中发挥了次要作用，因为它被吸收和排泄过快。因此，我们使用外科技术中描述的改进方法，将MB注射到体外肿瘤引流区域的主要血管中，并在淋巴结检测中取得了更好的染色效果。理想的示踪剂应具有以下特性：不受外部条件影响，易于操作，有效且无副作用。我们发现T阶段，肿瘤分化程度，肿瘤位置和BMI对两种染色方法影响较小。在这项研究中，可以从肠系膜脂肪组织中轻易识别出黑色或蓝色染色的淋巴结，并且在患者，外科医生和病理学家中没有发现任何副作用。但是，本研究中获得的结果可能受到样本量的限制。将进行更大样本的进一步研究。

总之，体内 ACNS 和体外 MB 均有效作为增加CRC中检测到的淋巴结数量的示踪剂。它们可能在CRC的前哨淋巴结活检和微转移的研究中起关键作用。

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