发布日期：2018-11-07 11:32 来源：活性炭网 作者：活性炭网 浏览数：
抽象 十氯酮（Kepone）（CLD）是一种高度持久的农药，广泛用于法属西印度群岛; 目前仍在大型农业区发现高水平的CLD。 由于CLD主要通过非自愿摄取从土壤转移到动物，因此在污染区域饲
十氯酮（CLD）是一种被认为是持久性有机污染物（POP）的氯化多环酮农药。在马提尼克岛和瓜德罗普岛（法属西印度群岛）使用这种农药对抗香蕉黑象甲（Cosmopolites sordidus）导致大量这种农药在1993年在法国正式禁止之前传播。由于这种污染物在土壤中高度保留和持久，大面积农业土壤的表层极度污染（> 1mg / kg）[ 1 ]。据信，这种污染甚至持续了几个世纪[ 2 ]。此外，它的亲脂性（log Kow = 4.5 [ 3 ]）和对动物组织的高亲和力导致这种农药在动物中的显着积累[4 - 7 ]。因此，已经提出了与从土壤到动物的CLD转移相关的主要人类健康问题，特别是在当地动物食品生产方面。因此迫切需要避免污染室外饲养动物的策略。
CLD-转移到羔羊[ 8 ]，仔猪[ 9 ]和蛋鸡[ 10 ]已被证明不受安的列斯土壤（nitisol或土壤溶胶）的类型和性质的限制。这种转移的具体效率与这种农药对户外饲养动物的可用性有关。减少土壤结合CLD可用性及其进一步潜在吸收的方法可以是将这种污染物隔离成不可吸收的形状。活性炭（AC）被认为是用于许多有机污染物[封存一个潜在的介质11 - 14 ]，并已经用在法国西印度群岛[以净化水15。因此，就地 使用AC的隔离可能是限制CLD从土壤转移到动物的有希望的手段。
本研究旨在评估两种不同AC的有效限制CLD从土壤转移到幼嫩反刍动物的潜力。
实验设计旨在比较CLD污染的土壤中补充或不补充CLD生物利用度与来自褐煤（DARCO）或椰子壳（ORBO 32）的两种不同AC源。
三组随机分配的山羊小孩（每组n = 5）喂养这3种土壤中的一种。在暴露期间（第1天至第21天），儿童每天接受含有一片实验性土壤的湿润面团球，暴露剂量为10μgCLD/ kg体重。在污染期结束时（第21天），对动物实施安乐死，以收集肾周脂肪组织和肝脏。使用LC-MS / MS测定那些组织中CLD的浓度。土壤的相对生物利用度（RBA）的因素结合的CLD使用CLD的浓度在脂肪组织和肝脏[估计16，17 ]。本研究的实验设计如图1所示。
使用了15个4个月大的阿尔卑斯山男孩（Capra hircus，来自法国Laneuvelotte）。在开始暴露期之前，允许动物进行21天的适应期。每个实验组（n = 5）保存在覆盖有稻草的笼子中，并在URAFPA动物设施（法国Vandœuvre-les-Nancy，洛林大学）中配备单独的饲养器。温度保持在20-21℃之间。每2天对所有动物单独称重。通过从提供的口粮中减去剩余物来估计每日摄取量。随意提供水在整个研究过程中通过乳头饮水器。该项目获得了动物实验伦理使用机构委员会的批准（授权号：00270.02，由法国高等教育和研究部授权），并严格按照“护理和使用指南”中的原则进行。法国农业部，农业食品和林业部的实验动物和欧洲理事会指令（欧洲指令2010/63 / EU）。
表面比表面积（SSA）在LIEC实验室（法国Vandoeuvre-lès-Nancy）使用77K氮吸附法测量并在Belsorp-mini II装置（BELJAPAN，Inc Chemicals，JAPAN）上进行。然后使用BET方法估算SSA，使用16.3Å的氮分子横截面积[ 18 ]。进行De Boer方法以确定外表面积。
DARCO显示793.8±14.5 m2.g的SSA -1和ORBO的1126.3±11.9米一个SSA 2 .G -1。微孔表面分别占DARCO和ORBO总孔隙率的56％和80％。表1中描述了所用化学品和土壤的制备。
| 砂 | 高岭土 | 活性炭 | 活性炭 | 开蓬 | 成熟的时间 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 见Sand（Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany） | （Sigma-aldrich，St Louis，USA） | DARCO®（Sigma-aldrich，St Louis，USA） | ORBO32®（Sigma-aldrich，St Louis，USA） | 浓度（DM的μg.g- 1）（Sigma-aldrich，Supelco） | 在几天内 | |
| 标准土壤（SS） | 77.8％ | 22.2％ | - | - | 100 | 21 |
| SS与DARCO（AC） | 76.2％ | 21.8％ | 2％ | - | 100 | 21 |
| SS与ORBO（AC） | 76.2％ | 21.8％ | - | 2％ | 100 | 21 |
百分比是人造土壤的DM基础。
根据OECD指南[ 19 ] ，如表1所述制备三种人造土壤。首先，标准土壤（SS）仅含沙和高岭土（Sigma-Aldrich，St Louis，USA）。该土壤满足OECD人工土壤的成分和pH值，除了泥炭藓泥炭部分，其中不包括以避免与CLD的任何吸附竞争。第二种土壤（DARCO）基于SS并补充有DARCO（Sigma-Aldrich，St Louis，USA），第三种土壤（ORBO）基于SS并含有ORBO 32（Sigma-Aldrich，St Louis，USA）。在ORBO和DARCO土壤中，添加AC以达到土壤质量干物质的2％。
每克土壤干物质加入所有三种土壤以达到100μgCLD（Kepone，Supelco，Sigma Aldrich，Saint-Louis）。使用CLD（20:80;体积：体积;甲醇：水）的含水混合物将CLD涂布在土壤上。然后，用刮刀彻底手工混合所有样品10分钟。在抽油烟机下蒸发溶剂痕迹过夜。然后，加入milliQ水以使每个小瓶中的水分含量达到17.5％。在另外的10分钟期间，使用刮刀将土壤样品彻底手动混合。将所有三种土壤在20℃下储存在琥珀色玻璃小瓶中，持续3周，直至暴露的第一天（第1天）。
所有山羊小孩每天根据其个体体重暴露于一个土壤部分。在暴露前一天，将相应量的土壤（每10kg体重的1g土壤干物质）掺入湿润的饲料面团球的中心。在禁食过夜后，每天将面团球单独喂给孩子。
暴露21天后，孩子们被电子胸腔麻醉麻醉，然后立即放血。收集肾周脂肪组织作为通常在屠宰场收集的参考组织，以根据法国国家监测计划控制CLD残留[ 20 ]。鉴于该组织中高浓度的CLD，还收集了整个肝脏。将样品储存在-20℃并冷冻干燥。
根据ANSES PBM Pest LSA-INS-0164 v5 [ 21 ]的方法，在Morbihan的Departmental Analytical Laboratory中使用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）对这两种生物基质进行CLD定量（ LDA 56，Saint-Ave，France）。在这些基质中，定量限（LOQ）为2.0μgCLDkg -1，并且检测限小于每公斤测试基质0.7μgCLD。
该分析方法最初由法国食品，环境和职业健康与安全局（ANSES，Maisons-Alfort食品安全实验室）开发，该实验室是法国该分子的国家参考实验室。该方法是法国[ 22 ] 目前使用的监管分析参考，根据欧洲法规[ 23 ]中确定的最大残留水平来控制食品中的CLD 。
在提取步骤之前，将13 C（13 C 8 C 2 Cl 10 O，Azur-同位素，法国马赛，98％纯度）CLD内标添加到子样品中。简言之，依次提取生物基质。（i）对于脂肪组织，将0.5g样品加入到3ml乙腈和二氯甲烷75:25（v：v）的混合物中。离心后（1 200 x g在-20℃下20分钟）提取上清液。该提取进行2次。然后，在氮气流下，在40℃下蒸发溶剂直至干燥。然后加入15ml己烷/丙酮85:15（v：v）的混合物。（ii）对于肝脏，使用2g的样品。向样品中加入10mL己烷：丙酮85:15（v：v），然后使用Ultraturrax（10000rpm，1min，S25N-10G）研磨。在混合后（涡®设备）和离心（750 X 克，3分钟）收集上清液。
进行碱化步骤，然后进行酸化步骤，以获得CLD水合物并重新形成CLD，如别处所述[ 24 ]。分析级氢氧化钠溶液（向上清液中加入5mL 0.5M NaOH水溶液）。一个混合步骤（涡后®装置）和离心（750 X 克，3分钟），收集上清液。该步骤重复两次。
将得到的水相用5mL己烷洗涤以除去脂肪。离心（750× g，3分钟）后收集上清液。通过硫酸（5mL的60％溶液）酸化溶液来重整CLD。第二提取阶段进行，用己烷：丙酮（5毫升85:15体积/体积的），随后混合（涡®设备）和离心（750 X 克，3分钟）。该提取步骤重复3次。然后用2mL水冲洗有机相，随后蒸发至干，然后加入1mL甲醇。
使用Phenomenex Aqua C18柱（150x2.0mm3μm）和柱前Phenomenex Aqua C18（4x3.0mm）实现分离。使用两相进行分离步骤：含0.1％甲酸的水（A）和含0.1％甲酸的甲醇（B）。每次注射5μL样品，流速设定为200μl/ min。分离后，进行使用乙腈的漂洗程序。通过API 5500进行同位素稀释定量。使用母离子（PI）和子离子（CI）分别量化（507/427 Da; PI / CI）和合格（509/429 Da; PI / CI）12 C CLD和量化（517/436 Da; PI / CI）13 C CLD。
LDA 56符合国际标准ISO / IEC 17025：2005（测试和校准实验室能力的一般要求）。此外，在应用动物食品分析方法ANSES PEST LSA-INS-0164 [ 21 ] 时，严格按照COFRAC（法国认证委员会）对LDA 56的质量认证进行分析。这种质量认证涉及频繁的实验室间测试。对于脂肪组织和鱼类，这种方法的不确定性被证明不到20％[ 21 ]。
低于LOQ的一些值被数据集中的LOQ值（测试基质中的2.0μgCLDkg -1）代替。
为了评估AC对污染物生物利用度的影响，进行了方差分析。实验单位是孩子。使用ANOVA程序和R版本3.2.3的Tukey-Kramer事后检验比较三个治疗组（SS，ORBO，DARCO;每组n = 5）在脂肪组织和肝脏中的CLD浓度（R统计计算基金会，奥地利维也纳）。差异被认为是显着的，P <0.05。
使用R（版本3.2.3，R Foundation for Statistical Computing）对CLD浓度进行统计学分析。每个孩子都被认为是一个实验单位。如其他地方所述计算浓度的95％置信区间[ 25 ]。
通过将“一次治疗后的一个组织（肝脏或脂肪组织）中的CLD-浓度（DARCO或ORBO）”除以“在SS治疗后在相同组织中获得的CLD浓度（100％参考）”来计算RBA，改编自先前描述的方法[ 16，17]。CLD剂量暴露与器官中CLD浓度之间的线性是该方法的先决条件[ 26 ]。之前对于羔羊的CLD证实了这种线性[ 8 ]。由于羔羊和山羊具有相似的生理学，因此在本研究中未评估CLD的剂量反应。
下面提供了在肝脏中进行一次AC治疗后计算CLD的RBA的相应方程式：
由于划分的每个部分都包含不确定性，因此通过不确定性规则的传播计算了RBA因子的95％置信区间[ 27 ]。上面提供了相应的等式：
AC的CLD保留因子被确定为SS处理后获得的浓度与使用ORBO和DARCO在相同生物基质中获得的浓度之间的比率。为了保守，使用CLD浓度的第 95 置信区间的最低值和最高值使该因子最小化。使用肝脏中CLD浓度的AC DARCO上面提供了计算的详细信息：
在暴露期间，每日摄取饲料不受处理的影响（16±3g.kg -1 .day -1，P> 0.10）。此外，在暴露期结束时，对日增重（160±50 g.day -1，平均值±SD，P> 0.10）没有显着影响。
生物基质中CLD的浓度显示治疗组之间的重要差异（参见 图2）。正如预期的那样，对于两种基质，在SS组（无AC）中获得最高的CLD浓度：155±22ng / g的DM（脂肪组织;平均值±SD）和2110±180ng / g的DM（肝脏;平均值） ±SD）。在DARCO处理的动物中获得中间体：41.3±5.2ng / g DM（脂肪组织;平均值±SD）; 干活化组织（<2 ng / g DM）和24.0±2.4 ng / g DM的ORBO处理动物的最低CLD浓度为449±71 ng / g（肝脏;平均值±SD），肝脏;平均值±SD）。
CLD的浓度以ng.g -1表示。值对应于平均值±SD。具有不同上标字母（a，b，c）的平均值在统计学上是不同的（P <0.05）。使用R软件的双向ANOVA程序和Tukey事后检验进行统计学分析。模型中使用了两种效果：器官和治疗。两种效应均显着（p <0.0001），RMSE = 12.84。（n = 5）。RMSE：Root表示平方误差。＃：值低于量化限制（LOQ）。
ANOVA分析揭示了两种生物基质的主要治疗效果（参见 图2）（两种组织的p <0.0001）。使用事后Tukey测试的进一步研究表明所有治疗组彼此不同（p <0.01）。
在每个治疗组中，肝脏中的CLD浓度比脂肪组织的浓度高> 10倍。两种器官之间的这些差异与先前在啮齿动物[ 28 ]，羔羊[ 8 ]，猪[ 9 ]和人类[ 29 ]中的观察结果一致。CLD对肝脏的这种特殊亲和力可以用非明确鉴定的易于结合CLD的蛋白质来解释[ 30 ]。
计算RBA因子以估计在以下处理后的CLD生物可利用部分：ORBO或DARCO。与SS相比，DARCO处理显示RAS为26.6％和21.2％（分别来自脂肪组织和肝脏），ORBO处理显示RCA为1.3％（来自脂肪组织的最大值）和1.1％（肝脏）。从脂肪组织和肝脏获得类似的RBA因子，除了脂肪组织的ORBO，其中只能评估最大值（因为所有浓度均低于LOQ）。因此，SS与DARCO。
进行统计分析以获得95％置信区间，如表2所示。为了评估AC在消化过程中的隔离效率，计算了隔离因子。DARCO显示减少53.4％（脂肪组织）和67.2％（肝组织）。ORBO显示出更大的减少98.2％（脂肪组织;基于LOQ）和98.4％（肝脏）（表3）。
| 脂肪组织 | 肝 | |
|---|---|---|
| SS与DARCO | 26.6％[12.0％-41.2％] | 21.2 [11.5％-30.9％] |
| SS与ORBO | 1,3％[NA] | 1.1％[0.7％-1.5％] |
括号中的值表示95％置信区间（2,7xSE）。通过误差传播公式计算SE。（n = 5）
| 脂肪组织 | 肝 | |
|---|---|---|
| SS与DARCO | 53.4％ | 67.2％ |
| SS与ORBO | 98.2％ | 98.4％ |
如材料和方法部分中所述计算减少系数。
在法国西印度群岛受污染地区，土壤中的CLD浓度在干燥土壤的0.011-52.1 mg.kg -1之间变化，Le Villain等人（2012年）使用作物保护服务（法国农业部）数据库报告[ 31 ]。CLD浓度的平均值和中值分别为2.1和1.1 mg.kg -1 [ 31 ]。因此，本研究中使用的土壤中CLD水平（50μg.g -1）与该数据库中的最大值（52.1 mg.kg -1）相似。因此，如果在现场条件下，CLD对AC介质的饱和不应该是限制性过程。
表面性质和AC的结构特征驱动CLD [的吸附程度15，32 ]。特别是，表面特异性活性（SSA）被认为与其结合潜力正相关[ 33 ]。本研究中使用的AC是微孔介质，即使ORBO比DARCO（56％）具有更大的微孔率（80％）。这些AC的前体材料（分别为ORBO和DARCO AC的椰子壳和褐煤）的差异导致不同的孔隙结构。在补充，这种纳米多孔材料结合存在于土壤[紧紧卤代化合物33 - 35]。此外，这种结构可以解释消化食糜中CLD解吸的局限性[ 36 ]。这一结果与上多氯联苯[先前的观察线16，36 ]。这种被称为“物理诱捕”有机污染物的过程是动物摄取CLD的一个非常有限的步骤[ 36 ]。如RBA因子所示，ORBO的有效性似乎比DARCO更大。这种差异可以通过ORBO显示的较高SSA（1126对794 m 2 g -1）来解释，导致其CLD结合能力增加。如此高水平的微孔性可以解释其物理诱捕CLD的能力。
两种AC在山羊孩子的消化过程中有效地保留了CLD。当添加到人造土壤中时，这些AC分别允许DARCO和ORBO的生物可利用部分的显着限制，范围从64％到98％。这些差异与两个AC的特定SSA有关。在研究AC在现场污染土壤中的影响之前，对人工土壤进行的这项研究是一个非常有希望的步骤。将开展进一步的调查，以评估法属西印度群岛不同水平的AC或CLD-历史污染土壤的封存效率。
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