介绍

加速动脉粥样硬化和增加的心血管事件的患者得到广泛证明跨越慢性肾脏病（CKD）的整个频谱[ 1，2 ]。事实上，在CKD患者过早心血管疾病（CVD）死亡的风险比进展到透析或移植的风险高得多[ 3，4 ]。此外，驱动CKD相关CVD的病理生理机制是复杂的，因为在一般人群中有效的治疗干预是不一致有益的，尤其是随着肾损伤的进展。因此，尽管降脂药可降低轻度至中度CKD患者的心血管事件[ 4]，在更晚期的CKD或透析中，尽管血清胆固醇降低，但未见益处[ 5 ]。这些研究结果表明，CKD相关动脉粥样硬化疾病的脂质非依赖性危险因素可能是关键，特别是当潜在的肾脏病情发展时[ 6 ]。

肾功能均匀适度降低的患者可能因肾脏内稳态改变而保留或产生物质，超过典型的“尿毒症”物质，血清肌酐和尿素。在肾疾病人类这些积聚物质调制已由口服木炭吸附剂实现，AST-120 [ 7，8 ]。这种干预减少了某些尿毒症毒素的循环和组织沉积，包括硫酸吲哚酯[ 9 ]和吲哚乙酸。AST-120延迟CKD进展，至少部分是由于在实验模型中[炎症的抑制10 - 12 ]。虽然目前尚未证实AST-120可降低人体血清肌酐加倍的发生率[13 ]，正在进行一项3期临床试验，以检查其对血清肌酐升高或移植或透析进展的复合终点的影响[ 9 ]。有趣的是，观察到AST-120治疗可以减少血液透析开始后的全因死亡率[ 14 ]。此外，在最近的一项研究中，第2-5期CKD患者的死亡率跟踪了硫酸吲哚酚的水平[ 15]。在目前的研究中，我们研究了AST-120是否也可以调节在肾损伤中观察到的动脉粥样硬化加速，并探讨了可能的机制。值得注意的是，动脉粥样硬化斑块随着时间的推移会改变成分，从早期富含脂质的富含​​巨噬细胞的病变到坏死的，无细胞的，可能不稳定的斑块病变。因此，我们还研究了AST-120在肾损伤发作时与已确定的肾损伤后是否对动脉粥样硬化病变有不同的影响。

材料和方法

结果

动脉粥样硬化病变

如通过苏丹IV染色在面部主动脉中评估的，与假手术相比肾脏质量减少的小鼠中的动脉粥样硬化显着增加（图1）。主动脉病变的程度与肾实质的减少程度成反比[Sham 3.2±0.4％，UNx 7.0±0.7％（与Sham相比P <0.05）和SNx 21.0±2.6％（P <0.05与UNx和< 0.01与Sham）]。AST-120不影响假动物的动脉粥样硬化受累程度。相比之下，AST-120导致UNx和SNx的动脉粥样硬化显着减少（图1）。

图。1

AST-120减轻动脉粥样硬化的肾脏损伤引起的加速发展恩面对主动脉病变。用苏丹IV染色的en面钉扎开放主动脉的代表性图片。显微照片中的条对应于5毫米。图表显示未治疗的次全切除术（SNx）中动脉粥样硬化程度的定量数据，术后即刻开始SNx与AST-120; 每个n = 5; 无治疗的单侧肾切除术（UNx），UNx与AST-120（UNx + AST-120）; 每个n = 5，假处理（假）或假处理为AST-120（Sham + AST-120）; 每个n = 5。* P <0.05与Sham组和† P <0.05与UNX。

由于apoE - / -模型中的第一个动脉粥样硬化病变发生在近端主动脉，我们还进行了主动脉窦的横断面分析（补充图1）。这一领域的病变在所有群体中都非常广泛。并联由观察到的结果的连接面的评估，与AST-120治疗显著减轻窦病变的程度在肾切除小鼠（436 138±13 594微米2在肾切除对348 827±34在肾切除+ AST-120，P 777 <0.05 ）。AST-120还用数字（478 876±44 843对比397 366±12 174微米减小窦病变小鼠的程度较小肾切除的[UNX 2在UNX + AST-120，NS）和假（434 285±20 063相对于472 337±37 421微米2 在Sham + AST-120，NS）]。

动脉粥样硬化病变的特征

已知几个关键特征会影响斑块稳定性（图2）。通过MOMA-2染色评估的巨噬细胞阳性病变区域在各组之间没有差异，并且不受AST-120的影响（图2A）。通过Sirius Red染色评估的胶原蛋白含量在各组之间没有差异（图2B）。通过von Kossa染色评估的钙沉积显示所有实验组中主动脉瓣的偶然染色和血管内膜中仅轻微沉积，而AST-120没有影响（数据未显示）。相比之下，UNx中坏死区域显着增加，SNx进一步增加（假手术组为3.4±0.7％，UNx组为7.6±1.2％，SNx组为9.5±2.0％; 图2C和D组;）。此外，AST-120减少了UNx和SNx的坏死区域（图2C和D）。这些发现表明，坏死区域的范围与肾消融的程度成反比，并且AST-120可以减轻斑块的这些潜在的不稳定区域。

图2

AST-120减轻近端动脉粥样硬化病变的坏死区域，但不减少巨噬细胞浸润或胶原含量。通过MOMA-2染色评估巨噬细胞占据的平均面积（A，每组n = 5），通过Sirius Red染色评估胶原（B，每组n = 5）和通过无细胞/无核区域评估的坏死区域Harris H＆E（C，每组中n = 5）分别计算为与动脉粥样硬化总损伤的比率。（D）在Sham，SNx和SNx + AST-120中用Harris H＆E染色的近端主动脉的代表性图片。显微照片中的条对应于100μm。*与Sham相比，P <0.05。

为了进一步确定AST-120有益作用的机制，我们还确定了可能参与动脉粥样硬化病变内坏死过程的几种炎症因子的表达。在SNx小鼠中，AST-120治疗显着降低MCP-1的主动脉​​信使RNA（mRNA）表达（SNx，1.34±0.11对SNx + AST-120，0.95±0.08，P <0.05），TNF-α（SNx， 1.31±0.05对SNx + AST-120,0.57±0.08，P <0.05）和IL-1β（SNx，1.26±0.28对SNx + AST-120,0.50±0.12，P <0.05）（图3））。在UNx小鼠中，AST-120引起了减轻炎症的定向相似模式（UNx与UNx + AST-120对于TNF-α，2.67±0.90对比UNx + AST-120,0.61±0.19，P <0.05，MCP-1： 1.65±0.32对1.07±0.12，NS，IL-1β：4.07±1.37对比1.56±0.48，NS）。先前已经证实用AST-120治疗可以调节残余肾组织中硫酸吲哚的沉积[ 12 ]。AST-120降低了动脉粥样硬化病变中硫酸吲哚的含量（SNx，47.4±2.8％对SNx + AST-120,34.9±2.7％，P <0.05; 图4）。与SNx中的结果类似，AST-120减少了具有UNx的小鼠中硫酸吲哚的沉积（UNx，37.2±3.2％对UNx + AST-120,12.4±4.1％，P <0.05）。AST-120还降低肝脏中的硫酸吲哚（SNx，57.0±2.8％对SNx + AST-120,34.5±1.3％，P <0.05）和肾脏（SNx，34.1±2.8％对SNx + AST-120,19.1± 3.6％，P <0.05）。

 

图3

AST-120减轻主动脉炎症mRNA的表达。通过实时聚合酶测量MCP-1（各组中A，n = 5），TNF-α（各组中B，n = 5）和IL-1β（各组中C，n = 5 ）的表达水平通过18S核糖体RNA归一化的链式反应。

图4

AST-120减少主动脉中的吲哚硫酸盐沉积。硫酸吲哚酚免疫染色表示为SNx（n = 5）和SNx + AST-120（n = 5）中油红O染色的动脉粥样硬化病变的百分比。在SNx和SNx + AST-120中用硫酸吲哚染色的近端主动脉的代表性图片。显微照片中的条对应于50μm。

讨论

本研究进一步观察到AST-120减轻了肾消融模型中发展的加速动脉粥样硬化。该益处不依赖于全身血压，血清脂质水平的降低或肾功能的改善。相反，AST-120改善动脉粥样硬化与斑块的组成变化有关，坏死区域和炎症减少。

CKD显着增加动脉粥样硬化和心血管事件[ 1，2 ]。这种有害的联系在晚期CKD患者中尤为突出，这些患者对常规降脂疗法的抵抗力最强[ 5 ]。在脂质的独立危险预测最近的兴趣已经确定炎症在普通人群的重要贡献者CVD 24，25 ]。该机制可以在CKD [的每一个阶段是心血管死亡率的一个特别相关的预测值26，27 ]。在这方面，AST-120，一种减少循环和组织尿毒症毒素的口服木炭吸附剂，延缓实验和人类CKD的进展[8，10 - 12 ]至少部分地通过抑制炎症[ 10，11，28 ]。因此，我们研究了AST-120是否可以调节肾脏质量减少引起的动脉粥样硬化加速。本研究发现AST-120可减轻肾损伤引起的动脉粥样硬化加速的发展。这种效应在具有最广泛的肾消融的小鼠中尤其显着（图1）。由于该模型中的疾病发展是从近端主动脉根部向下延伸到血管的长度，因此AST-120的治疗效果可能在最近发展的由en face捕获的病变中最明显。测量。所述有益效果是独立的BP或血清脂质，调查结果，继与血管紧张素II受体阻断剂（ARB）治疗对全身压力和血清脂质浓度上的脂质沉积有益效果和效果之间平行发散[ 29，30 ]。此外，AST-120在研究期间没有改变肾功能，表明血管益处与通过肌酸酐清除率评估的肾功能改善无关。

AST-120缺乏对完整肾脏小鼠动脉粥样硬化的有益作用，同时使肾实质减少的小鼠受益似乎与后者特别积累的因素有关，包括硫酸吲哚酯。同样，在没有这种肾损伤相关因素的情况下，AST-120在完整肾脏的假手术动物中无益。因此，假定AST-120吸附与肾消融相关的毒素，尽管确切地去除了哪些毒素仍然不确定。值得注意的是，AST-120对动脉粥样硬化的益处并未反映在Ccr的变化中。相反，AST-120可能吸附了残余肾组织产生的其他保留物质。在这方面，已显示AST-120在临床上降低了硫酸吲哚的血清和肾脏水平[ 9]和实验CKD [ 11，12 ]。在2-5 CKD阶段，硫酸吲哚酚也与血管僵硬度，钙化和死亡率增加有关[ 15 ]。在体外，最近显示硫酸吲哚酚与氧化应激介导的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和MCP-1 mRNA表达上调有关[ 31]。]。在目前的研究中，响应AST-120的动脉粥样硬化的减少伴随着尿中的吲哚氧基硫酸盐以及主动脉，肝脏和肾脏的减少。这些发现表明尿毒症毒素的沉积可能导致疾病进展。AST-120可通过减少组织沉积来部分地调节肾损伤诱导的动脉粥样硬化。反过来，这种硫酸吲哚酯的减少预期会减轻炎症。实际上，在AST-120处理的小鼠的主动脉中记录了炎症标记物的减少。我们的观察结果补充了最近的体外和体内研究结果，即外源性硫酸吲哚可激活白细胞 - 内皮细胞相互作用[ 32]以及临床发现显示血清吲哚硫酸盐与CKD患者的心血管死亡率相关[ 15 ]，并且在开始透析前接受AST-120治疗的CKD患者在开始透析后的5年生存率显着高于患者。在透析前没有接受过这种治疗[ 14 ]。总之，观察结果提高了AST-120可以调节CKD患者潜在血管病变的可能性。

除了减少动脉粥样硬化病变的程度外，目前的研究还表明AST-120调节这些病变的特征。坏死区域的评估已经被应用在具有完整的肾脏[小鼠表征先进病变20，33 - 35 ]。该评估为斑块负荷的评估提供了重要的额外见解，进一步加深了我们的理解，即动脉粥样硬化斑块不是静态的，而是经历动态重塑，影响斑块稳定性。以前，我们发现脂质含量和组成，巨噬细胞浸润，胶原蛋白含量和弹性蛋白完整性的变化受到病变阶段和治疗干预的影响[ 29，30，36 ]。因此，尽管动脉粥样硬化病变内的坏死区域在UNx和SNx中均显着增加，但在肾损伤开始时，AST-120在两组肾消融小鼠中降低了这些区域（图2C和D）。斑块成分是急性冠状动脉事件风险的重要组成部分，因为易损斑块增加炎性细胞因子，扩大坏死区域，诱导局灶性胶原沉积减少，易发生破裂和血栓形成[ 37 ]。事实上，选择性缺乏巨噬细胞p38αMAPK的apoE - / -小鼠坏死和凋亡病变增加，尽管近端动脉粥样硬化病变没有变化[ 20]]。在用酪氨酸激酶Mertk受体缺陷的巨噬细胞重建的小鼠的动脉粥样硬化病变中也观察到与减少的细胞增多症相关的坏死和凋亡增加[ 33 ]。该研究表明，较少的细胞增多症和更多的细胞凋亡预示着微环境中更大的炎症反过来会促进更多的坏死病变。相反，在渐进肾损伤减轻胶原沉积的有益作用，在动脉粥样硬化病变的维护胶原被认为是对粥样硬化斑块[有益的稳定化效果29，30]。我们的结果表明，AST-120可以防止胶原蛋白含量的显着降低，同时还可以减少坏死性病变，这一结果支持了AST-120治疗促进更稳定的动脉粥样硬化病变的观点。

AST-120显着抑制了几种炎症标志物的基因表达。有趣的是，除了AST-120之外，其他干预措施已被证明有益于肾损伤相关的动脉粥样硬化，包括ARB [ 29 ]和氧化应激和炎症抑制剂[ 38 ]。每个这些干预的独立的对全身血压的影响动脉粥样硬化的好处，循环脂质水平或肾功能[ 29，38 ]。相反，益处已与动脉粥样硬化的炎症成分[减少相关联29，38 ]。ARB还被证明可以调节动脉泡沫细胞中的巨噬细胞浸润和脂质体内平衡[ 29，36 ]。我们最近发现，UNx降低肾脏质量不仅可以增加动脉粥样硬化，还可以激活巨噬细胞NFκB，这是炎症通路的核心因子[ 36 ]。值得注意的是，ARB治疗可减少NFκB活化，减少病灶大小[ 36 ]。这些有益疗法的共同点似乎涉及干扰炎症，这可能是直接的，或者与AST-120的情况一样，间接地通过降低吲哚硫酸盐水平。抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸还可抑制肾损伤引起的动脉粥样硬化加速，减轻动脉粥样硬化的炎症成分[ 38]。相比之下，我们观察到在有/无AST-120的任何实验组中，在一些主动脉瓣叶中仅有轻微和零星的钙沉积，在血管内膜或培养基中几乎没有阳性染色。这些结果与以前的报告之间的差异描述肾切除小鼠血管钙化[ 39 - 41 ]可以反映更严重的肾功能障碍，差异与肾切除和/或饮食组合物差的方法中，这可能会影响维生素d，钙水平和磷酸盐，这将有利于组织钙沉积。

总之，我们的研究表明，AST-120可减轻动脉粥样硬化的发展，并减少apoE - / -小鼠肾功能不全与血管炎症减少相关的不稳定斑块特征。这些结果为使用AST-120在一系列CKD中减少患者的心血管事件提供了进一步的支持。由于ARB疗法是CVD疗法的支柱在一般人群中，并减少血液透析患者[实验CKD动脉粥样硬化以及心血管发病率和死亡率42，43 ]，则可能的是，ARB和AST-120的组合可以是特别有益于减少CKD中的CVD。