抽象

介绍

多氯二苯并- p -dioxins和呋喃，或简单地二恶英，是一组在环境中是普遍的持久性有机污染物（费拉里奥等人，2000。 ; Gadomski等人，2004。 ）。二恶英暴露，通常来自鱼类或乳制品等食物，部分是河流沉积物和洪泛区持续存在和积累的结果，需要不断进行补救（Yamashita等，2000 ; Ghosh等，2011）。与用墙壁和封盖进行疏浚或隔离相比，替代修复方法（如原位活性炭（AC）吸附剂修正）是一种经济上可行的控制机制（Bridges et al.2010 ; EPA 2013））。因此，AC最近已在全世界的多个污染场所实施（Patmont等人，2015）。尽管AC越来越多地使用并证明了AC降低水生无脊椎动物和蚯蚓中二恶英的生物利用度的可能性（Fagervold等人，2010 ; Josefsson等人，2012）对哺乳动物的影响，但其居住的肠道微生物群受到的关注较少。

This question was addressed, in part, in a recent study that examined the availability of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) amended to AC (AC-TCDD) in a murine model (Boyd et al. 2017). Classic markers of TCDD-induced toxicity were measured including modulation of the IgM antibody-forming cell (AFC) and the dioxin-inducible cytochrome P450 family cyp1a1 messenger RNA (mRNA) gene expression. Results from that study supported the use of AC to eliminate bioavailability of dioxins in mammals in that TCDD-induced host responses were observed only when administered with corn oil (CO-TCDD). Responses were not observed with equivalent TCDD doses administered with AC.

本研究的目的是（1）检测TCDD在小鼠模型中共生的关键肠道上与AC（AC-TCDD）隔离的生物利用度，以及（2）表征AC对肠道微生物群的影响。这是一个重要的问题，因为肠道微生物群在宿主健康和免疫能力中起着至关重要的作用（Littman和Pamer 2011 ; Honda和Littman 2016）。先前的研究已观察到的肠道共生体，包括TCDD诱导的生态失调暂定 Savagella也称为分段丝状菌（SFB），厚壁菌门，和肠杆菌科（Bhaduri 2015 ; Lefever等人2016。 ; Stedtfeld等人2017。，分段丝状细菌对暴露于TCDD的生殖小鼠的转录组学反应的调节作用，提交）。我们小组和其他人进行的实验表明，肠道共生反应是TCDD诱导宿主毒性的结果，部分通过芳烃受体（AhR）介导，而不是TCDD对细菌的直接影响（Lefever等。2016 ; Stedtfeld等人2017年。）。鉴于最近证明AC-TCDD对小鼠标志性反应的生物利用度有限（Boyd等人，2017），我们假设关键肠道共生体的反应也会减弱。为了检验这一假设，检查了SFB的转录组学反应，之前已经证明它对TCDD诱导的毒性有反应（Bhaduri 2015 ; Stedtfeld等。2017）和其他AhR配体（Zhang et al.2015 ）。

第二个问题是检查食品级AC对肠道微生物组的影响。除了通过摄入进入食物链的潜力外，AC还被用于从结肠中去除残留的抗生素水平（Khoder等人，2010），或作为食品添加剂以降低动物饲料中污染物的生物利用度（Avantaggiato等，2004） - 畜牧业中抗生素的潜在替代品（Chu等，2013）。AC也被用作意外剂量有毒物质或过量的紧急处理（Holt和Holz 1963）。它越来越多地用作肠道疾病和排毒的补救措施或补充剂。然而，AC干扰肠道微生物组和随后宿主健康的可能性尚未得到很好的记录。这里通过16S核糖体RNA（rRNA）基因测序检查，使用从暴露于AC-TCDD的小鼠的回肠组织中提取的DNA。

材料和方法

结果

AC-TCDD对SFB的影响

与初始对照相比，ATCDD引发的宿主反应显着影响了仅给予10μg/ kg CO-TCDD的组中SFB的绝对丰度（图1a）。在任何剂量的AC-TCDD中均未观察到TCDD诱导的SFB反应。总体而言，与未接受过TCDD的CO和10μg/ kg AC-TCDD组相比，在给予10μg/ kg CO-TCDD的组中观察到高出5.0倍，8.5倍和3.7倍的SFB水平，分别。10μg/ kg AC-TCDD和AC对照（倍数变化= 0.92）和幼稚组之间没有可测量的差异（倍数变化= 2.28，p = 0.98）。在重复实验中观察到类似的结果，其中仅在接受最高剂量的CO-TCDD的组中观察到SFB的显着增加（图S2）。）。与先前描述的研究一致，在AC上施用的TCDD消除了小鼠中的毒性反应（Boyd等人2017）和随后对肠道微生物组的关键成员的影响。然而，SFB未观察到先前用宿主生物测定法观察到的浓度依赖性剂量反应。

图。1

响应于0，0.1％，1.0或10微克/千克TCDD从回肠组织SFB基因表达的QPCR分析用玉米油载体（CO_TCDD）给药或吸附到活性炭（AC_TCDD）：一个 SFB特异性16S rRNA基因的表达引物组和b表达SFB功能基因（n = 21个引物组）。从ANOVA中列出p值，其中在幼稚，CO与没有TCDD（CO）之间进行多重平均比较Sidak测试，在AC上施用10μg/ kg TCDD（AC_10TCDD）与在CO上施用10μg/ kg TCDD（CO_10TCDD）。数字0.1,1.0和10表示每千克剂量TCDD的微克数

为了进一步验证仅在给予CO的组中TCDD诱导的SFB生态失调，还通过qPCR分析回肠组织中选择的功能基因的表达。选择用于分析的功能性SFB基因包括推定宿主相互作用的因子（Pamp等人，2012）。用10μg/ kg CO-TCDD检测的功能基因数量（检测到的基因数为11.8±6.2）高于其他组（检测到4.3±4.0个基因数）。对于10μg/ kg CO-TCDD组小鼠，所有测试的功能基因的总和表达也显着更高（图1b）。施用AC-TCDD的所有组均未显示SFB功能基因表达的显着增加。

与所有其他组相比，10μg/ kg CO-TCDD组中功能基因（标准化为SFB特异性16S rRNA基因）的相对表达倾向于降低（图2a）。然而，这仅在推定的D-ala-D-ala-dipeptidase基因中显着（图2b），并且在推定的纤连蛋白结合蛋白中倾向于更低（p = 0.06）。仅对在给定组内的大多数重复中检测到的基因进行相对表达分析; 因此，只显示了11个基因（图2a）。检测到的所有基因的平均表达显示，虽然在给予10μg/ kg CO-TCDD的组中SFB 16S rRNA基因增加，但是功能基因之间的表达水平不同（图S3）。）。总之，SFB功能基因的表达进一步证实了当吸附到AC上时TCDD不具有生物可利用性。

图2

QPCR分析SFB功能基因在回肠中的相对表达。一个表示-Log火山图10 p值和Log 2倍数变化比较10微克/千克TCDD给药组的相对起作用的基因表达与施用玉米油（CO_10TCDD）与所有其它基团和b推定d的相对表达-ala-D-ala二肽酶基因。将功能基因相对表达标准化为SFB特异性16S rRNA基因

AC和CO对肠道微生物组的影响

对16S rRNA基因进行测序以检查AC和CO对回肠中肠道微生物群的影响。结果显示AC显着增加了回肠中乳杆菌科的数量（图3b）。两个单独的细菌群在响应显著下降到AC包括Ruminococcaceae和Rikenellaceae（图3c，d）。还检查了Chao和Shannon多样性指数，并且由于AC，CO或TCDD没有观察到多样性的显着变化（图S4）。虽然Shannon多样性指数倾向于低于AC给药组，但这并不显着（p = 0.114）。

图3

使用从回肠中提取的DNA比较幼稚小鼠与给予玉米油（CO）或给予活性炭（AC）的组的16S rRNA基因序列分析。一个表示-Log火山图10 p值和Log 2对于被分类在与AC给药天真的小鼠和小鼠之间的家庭级细菌序列变化倍数b - ð与AC显著影响该分类的家族

CO是在小鼠研究中施用TCDD和其他AhR配体的常用载体（Fernandez-Salguero等人，1996 ; Bruner-Tran和Osteen，2011），也影响肠道微生物群（图S5b），但程度低于之前的程度。用芝麻油观察。详细地说，在给予CO的小鼠中，只有三种细菌家族，包括甲烷嗜血杆菌，丹毒科和来自梭状芽孢杆菌的组显着减少（p <0.05）。在我们之前的研究中使用芝麻油 - 一种常见的载体（Brown et al.1998 ; Kopec）等人，2008），我们观察到，在移位SFB，方面相对TCDD的响应厚壁菌门和肠杆菌科（Bhaduri 2015 ; Stedtfeld等2017，提交）。例如，与给药前1天的相对丰度相比，初始剂量的芝麻油分别在粪便颗粒中的肠杆菌科减少~10倍和300倍，3天和7天。然而，与初始给药后5天测量的回肠或粪便颗粒中的幼稚对照相比，肠杆菌科不受CO影响（图S6）。总的来说，与芝麻油相比，CO可能是更合适的载体，用于研究宿主毒性和肠道调节与持久性有机污染物的影响。

讨论

选择SFB作​​为标记因为它与宿主免疫相互作用（Ivanov等人2009）并且在鼠模型中响应TCDD（Stedtfeld等人2017 ; Bhaduri 2015）。先前的研究已经推测在肠道微生物，包括SFB这种转变，是免疫系统的TCDD诱导的调制的间接响应（Zhang等人2015年。 ; Lefever等人2016。 ; Stedtfeld等人2017年。）。实际上，用抗羊红细胞免疫球蛋白M抗体形成细胞评估TCDD对这些小鼠免疫功能的影响，在剂量低至0.1μg/ kg CO-TCDD时诱导显着抑制体液活性（Boyd等。 2017年）。在小鼠粪便中测量，先前的研究还发现，粘膜免疫维持者缺乏的小鼠显示出SFB丰度增加10倍（Upadhyay等人，2012）。此外，体外研究还表明，TCDD并不直接影响肠道共生（Lefever等，2016 ; Stedtfeld等，2017）。总之，这些结果进一步证实细菌生态失调是由于TCDD诱导的宿主变化。如果生态失调是TCDD诱导的宿主腔内代谢物变化或免疫抑制的结果，则需要进行额外的分析来区分。

与CO相比，具有10μg/ kg CO-TCDD的SFB的数量显着更高仅在RNA中观察到而在DNA中未观察到。通过用DNA进行16S rRNA基因测序来测量，SFB仅响应于TCDD倾向于更高（倍数变化= 2.2，p = 0.15）。其他细菌群（例如，肠杆菌 ; 图S6）也如先前研究中所述（Ttedtfeld等人2017，提交; Lefever等人2016）对TCDD作出反应。小于10μg/ kg TCDD的剂量在此研究中没有显着影响SFB，这在之前已被观察到（Bhaduri 2015 ; Fader等2015））。详细地，先前观察到TCDD剂量的SFB丰度的显着变化，其中每4天施用1至30μg/ kg，持续28天（Bhaduri 2015）。我们怀疑与先前的研究（28至90天）相比，该实验的持续时间较短，影响了整体细菌反应。假设小鼠的TCDD半衰期为11天（Gasiewicz等，1983 ; Birnbaum，1986），理论分析显示两个实验的小鼠TCDD水平在测量时相似，但暴露持续时间不同。 （图S7）。如前所述（Boyd等人2017年），由于准确测量本研究中使用的低水平暴露的挑战，未确定鼠肠道粪便中TCDD浓度的分析测定; 使用AC进一步复杂化。

以前的研究测试AC作为猪抗生素的替代品，也通过培养分析观察到更高水平的乳酸菌数量（Chu等人，2013）。Chu和共同作者的研究还观察到大肠杆菌和乳酸水平显着降低。通常，由于有机酸的产生，乳酸菌被认为是益生菌，提供抑制病原生物的酸性环境。因此，短期摄入AC似乎不会对肠道微生物组的结构产生威胁性影响。

该研究的结果支持AC的补救性使用以使TCDD诱导的对小鼠宿主的肠道微生物组的反应静音。详细地，SFB功能基因仅用施用CO的最高剂量的TCDD表达。这最可能是由于如先前所证明的由AC隔离而消除宿主的生物利用度（Boyd等人2017）。通过对回肠内容物的16S rRNA基因分析测量，AC对肠道群落结构和多样性的影响最小。三名成员与AC显着转移，包括乳杆菌科的轻微增加，通常被认为是益生菌。与先前使用的芝麻油载体相比，CO载体在较小程度上影响肠道微生物群。总体而言，当在AC上施用TCDD时，肠道微生物组的关键成员的反应不存在。