木炭琼脂微孔板（CARA板）。

用另外的活性炭（0.4％，wt / vol）制备含有10％OADC补充物的7H11 Middlebrook琼脂。在含有大磁力搅拌棒的2升Erlenmeyer烧瓶中，将活性炭用1升7H11琼脂高压灭菌。将装有烧瓶的高压釜托盘装入1至2英寸水，以防止培养基沸腾出锥形瓶。高压灭菌后，将介质在缓慢搅拌下冷却至55℃。在培养基冷却至触摸后加入OADC补充剂。将含有培养基的2升锥形瓶保持在55至60℃的磁力搅拌板上，以最慢的速度（1至1.5，使用VWR热板搅拌器）将木炭保持在悬浮液中并防止颗粒沉降。使用Rainin 12通道多管移液器将200微升7H11-OADC-木炭加入到96孔Corning微孔板孔中。注意避免在孔之间滴下液体琼脂，因为琼脂可以在孵育时支持霉菌的生长。提示经常更改，因为介质迅速固化并阻塞提示。固化后，将琼脂平板置于大的Ziploc袋中以防止干燥并在4℃下储存。使用前，将平板平衡至室温（RT）并干燥它们的盖子以除去冷凝。过度干燥的CARA平板可能会立即吸收刃天青（7-羟基-3）提示经常更改，因为介质迅速固化并阻塞提示。固化后，将琼脂平板置于大的Ziploc袋中以防止干燥并在4℃下储存。使用前，将平板平衡至室温（RT）并干燥它们的盖子以除去冷凝。过度干燥的CARA平板可能会立即吸收刃天青（7-羟基-3）提示经常更改，因为介质迅速固化并阻塞提示。固化后，将琼脂平板置于大的Ziploc袋中以防止干燥并在4℃下储存。使用前，将平板平衡至室温（RT）并干燥它们的盖子以除去冷凝。过度干燥的CARA平板可能会立即吸收刃天青（7-羟基-3）H-苯并恶嗪-3-酮-10-氧化物）溶液，导致变化或不能确定荧光单位。

结核分枝杆菌的 CARA 。

图2显示了一个概述。结核分枝杆菌的单细胞悬液在含有200μl特异于复制或非复制条件的液体培养基的96孔微量培养板中暴露于测试试剂或二甲基亚砜（DMSO）媒介物对照7天。DMSO保持在1％终浓度。将化合物稀释液置于第3至11列中，并且载体对照在第2列中。第1列和第12列不含测试试剂，但填充有200μl无菌Dulbecco's PBS以使内部孔的蒸发最小化。使用A至H行。制备剂量 - 反应测定，每个浓度重复3次。结果表示为平均荧光±标准偏差（SD）。在第7天，将细胞与设置为40μl的P200多通道移液管混合（向上和向下移液10次，同时以圆周运动搅拌以确保孔底部边缘上的细胞混合）; 然后，使用P20多通道移液管，将10μl点在7H11-OADC-木炭琼脂平板（CARA微量培养板）的表面上。在测试孔转移到CARA微孔板进行生长的同一天，11个2倍稀释的野生型单细胞悬浮液从OD 580为0.1 开始的结核分枝杆菌培养物在来自孔1至11的CARA微量培养板中以8个重复点样。该板用作标准曲线。将接种的微孔板堆叠，置于Ziploc袋中，拉链开裂，并在37℃，20％O 2和5％CO 2下孵育7天。在第7天，人们可以观察到在对照孔中生长的大量微菌落。将40微升1：1的alamarBlue（AB）储备溶液和10％聚乙烯山梨糖醇酯（吐温80 [TW80]，10％体积/体积的双蒸水[ddH 2 O]）溶液直接加入到表面微孔板和结核分枝杆菌微菌落增长。显影剂为AB-TW80。如果CARA板在37℃温育期间变得干燥，则建议在加入AB-TW80显影液之前用40μl7H9-OADC预先润湿所有孔。该技术可以帮助防止CARA显影剂吸收到琼脂中。

 

图2

CARA的示意图说明了8种假设化合物的结果，其具有标记的不同的复制和非复制活性，表现为示意图下部的微量测试板孔中细菌减少的刃天青的粉红色。用于OD 580读数的微孔板是浅色的：白色孔表示没有生长，棕色孔表示由于生长而产生的浊度。由于木炭处于悬浮状态，CARA微孔板孔是黑色的，并且在没有细菌来减少刃天青的情况下保持黑色，但是如果细菌生长则变成亮粉红色。MIC / CARA结果的这8种组合的详细描述以及如何解释它们可以在补充材料的图S5和S6中找到。PAE *，抗生素后效应。

将板缓慢地来回摇动以确保AB-TW80混合物涂覆在孔的表面上。将板再次装袋并在37℃下孵育1小时。如果结核分枝杆菌将菌落团块漂浮到液体表面，轻轻地将其向下推，以确保它被AB-TW80溶液润湿。在添加AB-TW80后1小时，将CARA微量培养板置于生物安全罩中，并移除盖子15分钟以进行温度平衡，这对于避免会影响荧光读数的盖子或贴纸上的冷凝物积聚是至关重要的。将光学质量PCR贴纸（Denville）放置在板的表面上并使用Kimwipe压在板上以形成紧密密封。通过顶部读数确定荧光，激发波长为530nm，发射波长为590nm（SpectraMax M5; Molecular Devices）。刃天青粉是商业alamarBlue的较便宜的替代品，可用于制备CARA显影液：0.01％刃天青（wt / vol）在无菌Dulbecco'中

耻垢分枝杆菌的 CARA 。

所述耻垢分枝杆菌 CARA是相同于结核分枝杆菌 CARA，但有以下不同之处：与7H11琼脂而不OADC补充剂制备微孔板CARA，药物暴露的长度为24个小时; CARA平板上细菌回收的时间为24或48 h; 将吐温80溶于Dulbecco's PBS（氯化钙和不含氯化镁; Gibco）代替水。

化学品来源。

除非另有说明，否则所有化学品均来自Sigma，具有最大纯度。我们非常感谢H. Boshoff和TB联盟分别提供TMC207和PA-824。

药物结合试验。

将测试试剂从DMSO原料添加到含有或不含0.5％BSA或0.4％活性炭（wt / vol）的Dulbecco's PBS（氯化钙和不含氯化镁; Gibco）中。在室温下20分钟后，使样品通过10-kDa分子量（MW）截止滤器（Amicon）以除去残留的炭 - 和BSA-药物复合物。通过液相色谱 - 质谱（LC-MS）分析流出物的任何未结合的药物。为了解决在稍后时间点与木炭的结合，在含有或不含有0.4％活性炭（wt / vol）的PBS中含有化合物的微孔板在室温下温育18-24小时。然后将微孔板离心以沉淀木炭，并通过LC-MS分析上清液。

活性炭对未经处理的结核分枝杆菌检测的影响。

在我们的多重非复制试验（6）的单板，384孔格式中，化合物以其原始筛选浓度的20％转移到非复制试验的复制生长期（图1）。）。如上所述，有效的复制活性化合物可通过在测定的生长期杀死而记录为潜在的非复制活性化合物。为了减少这种假阳性结果，我们补充了含有0.4％（wt / vol）活性炭的液体7H9-甘油细菌培养基。需要不断搅拌以使木炭粉末保持悬浮状态。此外，活性炭使7H9培养基脱色（参见补充材料中的图S1a），表明它结合了小分子成分，木炭淬灭了刃天青的荧光（参见补充材料中的图S1b），其还原为试卤灵。是相对的分枝杆菌的数字（的有用的定量反射30，31）。为了避免这些问题，我们使用基于琼脂平板的方法来代替基于液体的生长（图2）。活性炭是细菌琼脂中的常见补充剂，其中它仍保持均匀悬浮。向7H11-OADC琼脂添加0.4％（wt / vol）活性炭对结核分枝杆菌 CFU 的数量或其出现时间没有可检测的影响，尽管菌落通常略小（参见图S1c和d）。补充材料）。当未处理的结核分枝杆菌从复制条件中取出并分配到木炭琼脂上时，在第5天就可以看到小菌落。当结核分枝杆菌时来自非复制条件，在第7天到第10天可检测到微菌落。微菌落太小而不能可靠计数，并且微孔太小而不能支持统计学上有用数量的离散大孔隙。因此，为了对琼脂表面上的结核分枝杆菌生物量进行半定量，我们在CARA的每个孔中的微菌落顶部添加alamarBlue和Tween 80作为1：1混合物（体积/体积，100％alamarBlue和10％TW80）。通过顶部读数记录并记录荧光。在37℃温育1小时后，很容易检测到未处理的结核分枝杆菌产生的荧光（图2）。较长的孵育时间被吸收AB-TW80显影液的琼脂和木炭介导的荧光猝灭所混淆（参见补充材料中的图S1b）。

荧光（线性）与未处理的结核分枝杆菌杆菌（log）的起始数之间存在线性对数关系，在培养板之前发现的结核分枝杆菌杆菌的2至3log 10范围内（图3）。因此，我们可以推断CARA荧光的完全丧失表明细菌数量减少≥99％。由于提供2 log 10杀灭结核分枝杆菌的最低浓度通常定义了抗生素的最低杀菌浓度（MBC 99）），我们推断在CARA中，产生高于背景的荧光的最低药物浓度可以作为MBC的替代物（参见补充材料中的图S5）。这种浓度在此称为“CARA- MBC≥99。”

 

图3

在接种后第7天或第10天开发CARA微板时，最初接种的结核分枝杆菌杆菌数和alamarBlue荧光的相关性。从OD 580为0.1（相当于〜5×10 7 CFU / ml）开始，将10微升10倍系列稀释的结核分枝杆菌 H37Rv 培养物点在NARA（a和c）的孔上或CARA（b和d）微孔板。在结核分枝杆菌是从指数生长的培养物在对数中期制备的单细胞悬浮液和未暴露于测试试剂。结果是在3个相似实验之一中来自8个重复的平均值±SD。

最初接种的结核分枝杆菌杆菌的实际数量在2至3 log 10动态范围内产生信号，并且范围是否超过2 log 10或3 log 10取决于允许结核分枝杆菌在CARA上生长多长时间加入刃天青的前板（图3a至TOD）d），以及在较小的程度上，对细胞进行多久用刃天青孵育记录荧光之前。结核分枝杆菌 10天的生长与7天的生长相比，在CARA平板上增加了灵敏度和动态范围。然而，我们使用了7天的孵化，因为它更快，其灵敏度足够。

包含木炭不影响荧光强度和初始细菌数之间的相对关系，如图3所示，用于比较CARA平板与正常琼脂刃天青酸测定（NARA）平板。然而，包含木炭确实降低了所获得的最大荧光强度，并且在更高的荧光强度下增加了重复的标准偏差（图3）。

对于快速生长的耻垢分枝杆菌（参见补充材料中的图S2）获得了类似的结果，对方案进行了微小调整。我们推断耻垢分枝杆菌的倍增时间更快（3小时与结核分枝杆菌相比，约18至24小时）需要更短的CARA孵育时间。在用AB-Tw80发育之前孵育24小时（参见补充材料中的图S2a）或48小时（参见补充材料中的图S2b）显示，类似于结核分枝杆菌的CARA，用于M的CARA .smegmatis有一个2到3 log 10 CFU的窗口。虽然48小时CARA孵育提供了比24小时CARA孵育更大的动态范围耻垢分枝杆菌，我们常规使用24小时CARA孵育来减少总体测定时间。对于非复制性耻垢分枝杆菌测定，我们决定在24或48小时基于DSMO处理的对照孔中是否存在可见生长来开发CARA板。

操作术语和数据分析，以区分杀菌和抑菌药物的作用。

基于以下结果以及从学术和工业合作中测试100多种复制，非复制或双活性化合物所获得的结果，我们制定了解释CARA数据的指南（表1和图2 ;另见补充材料中的图S5和S6）。为了清楚起见，我们在完成CARA验证的描述之前，在此提供指南。为了说明解释性概念，将参考稍后将在其特定结果的背景下再次讨论的图。

虽然将药物分类为复制和/或非复制活性化合物通常很简单（图2），但对于某些药物，复制活性化合物的进一步分类为抑菌或杀菌需要仔细分析CARA结果。根据定义，所有抑菌药物都会消除细菌复制。然而，对于药物保持分类为抑菌的细菌杀灭量没有标准化的定义，并且进一步CFU减少将分类改变为杀菌的点。对金黄色葡萄球菌等快速生长的细菌有活性的药物如果在24小时内降低CFU <99.9％则具有抑菌作用（32而对于缓慢生长的分枝杆菌有活性的药物通常被认为是抑菌剂，如果它们在15天内导致<99％的CFU减少（33）。这种抑菌 - 杀菌的区别是任意的，取决于药物暴露的时间，细菌菌株和种类，药物暴露期间使用的液体培养基的类型，以及用于回收的琼脂培养基的类型（33）。下面，我们说明用于CFU数据（CFU减少99％和99.9％图7N，，8H，8H，和and9a，图9a，，C，C ^，并和e）。Ë）。为了速度，我们选择将CARA中的复制药物暴露限制在7天而不是15天。对于非复制条件，7天药物暴露也是必要的，其中我们观察到7天后未处理的结核分枝杆菌杆菌CFU减少（26）。

 

图7

复制 - 抑菌分子。（a）预期具有抗生素后效应的抑菌化合物的结果。PAS（b，c），fenamisal（d，e），TMC207（f，g），乙胺丁醇（h，i），利奈唑胺（j，k）和乙硫异烟胺（R）的R-MIC 90和R-CARA数据的化合物l，m）与抑菌活性一致。PAS（b）和fenamisal（d）的插入物具有扩展的右y轴，以允许可视化正确的CARA- MBC≥99（这种解释方法在补充材料中的图S5中描述）。野生型复制（n）和非复制（o）结核分枝杆菌的 CFU在利奈唑胺暴露7天后确认CARA结果，预测它是复制 - 抑菌和非复制 - 无活性。为了帮助确定任何给定的化合物浓度是否无活性（生长），抑菌（静态）或杀菌（cidal），CFU图已经在零时刻相对于起始接种物的数据点右侧注释。显示了抑菌化合物的两种定义，其中化合物相对于起始接种物导致99％或99.9％的杀灭。用于复制暴露于PAS和fenamisal的结核分枝杆菌的 CFU数据显示在补充材料的图S4中。结果是在两个相似实验之一中3次重复的平均值±SD。

 

图8

双活性分子。（a）具有抗复制和非复制杆菌活性的分子的预期活性谱。被鉴定为双活性化合物的药物是PA-824（b，c），莫西沙星（d，e）和利福平（f，g）。用于复制（h）和非复制的（i）用利福平处理7天的野生型结核分枝杆菌的 CFU测定证实了CARA结果，表明利福平具有复制 - 杀菌性，具有适度的非复制 - 杀菌活性，其浓度比其R-MIC高出许多倍90和R-CARA。CFU数据显示3次相似实验中3次重复的平均值±SD。PA-824的CFU数据显示在图9中，对于莫西沙星，在图S3c中显示，在补充材料中显示d。

在另一个窗口打开

图9

当在补充有活性炭的7H11-OADC平板上计数结核分枝杆菌杆菌时，PA-824和TMC207显示较少的杀伤。CARA结果表明PA-824和TMC207是复制抑菌药物。当由复制CARA条件下测试的抑菌药物PA-824和TMC207显示标志后7天的暴露（图7f和and8b）8B）和非复制的条件（图7g和and8c）。8c）。通过CFU测定确定0.4％（wt / vol）活性炭对药物携带的影响，其中药物处理的复制（a，c，e）或非复制（b，d，f）的等分试样将细胞接种在含有或不含有0.4％活性炭的7H11-OADC上。P值（未配对Student's t检验）比较每种药物浓度的电镀±木炭。NS，不重要; *，P <0.2; **，P <0.1; ***，P <0.05。结果是在至少两个类似实验之一中3次重复的平均值±SD。

我们预计CARA- MBC≥99与标准液体培养液MIC 90的直接比较可能会区分抑菌和杀菌化合物（图2）。因为液体培养液MIC 90剂量响应曲线通常在生物学重复之间具有2倍的变化，所以MIC 90的显着差异通常被认为是> 4倍的那些。因此，当在液体培养液MIC 90下测试浓度≥4倍时，如果测试剂未能将CARA中的荧光降低至背景水平，则认为测试剂具有抑菌作用（图2 ;参见图S5）补充材料）。

当CARA曲线反映用于确定MIC 90的曲线时，CARA准确地预测了杀菌活性（图2 ;参见补充材料中的S6a），抑制药物的CARA结果可能难以解释（图2 ;还参见补充材料中的图S6b至d）。虽然一些化合物明显具有抑菌作用，因为相对于DMSO对照，它们对CARA荧光的影响极小（图2 ;参见补充材料中的图S6b和c），在某些情况下，CARA用于复制结核分枝杆菌未能明确区分抑菌和杀菌活性（参见补充材料中的图S6d）。这可以由表现出抗生素后效应（PAE）的抑菌化合物产生，其强烈抑制CARA平板上的菌落生长（图2），使得具有抗生素后效应的抑菌化合物产生与杀菌化合物类似的结果。

出于这些原因，我们引入了一个特定于复制测定的操作术语“静态窗口”（SW）来描述MIC 90和CARA-MBC 之间≥4倍的剂量响应变化（窗口）≥99（参见补充材料中的图S6d）。静态窗口是抑菌化合物子集的标志，例如利奈唑胺（稍后描述）。静态窗口的主要特征是2倍：CARA荧光必须以剂量依赖的方式降低到背景水平，CARA- MBC≥99比MIC 90高≥4倍。在某些情况下，只有在扩展y之后才能通过目视检查绘制的结果来辨别静态窗口轴，以确定CARA荧光升高到背景之上的药物浓度（参见补充材料中的图S5b和c）。静态窗口可预测抑菌活性; 然而，它们不排除如已经观察到的氟喹诺酮抗生素（一定的杀菌活性可能在一些药物浓度或更长药物暴露发生的可能性34，35）。

因为非复制试验是抑菌的并且与复制的生长阶段相结合以允许存活的细胞增加生物量，所以复制无活性的药物必须是非复制性的 - 杀菌的以产生NR-MIC 90（图1）。对于非复制特异性化合物，CARA荧光的减少可归因于CFU减少，并且静态窗口的概念不适用。

对于基于R-MIC 90至NR-MIC 90比率推断为候选双活性的化合物（图1），剂量依赖性NR-CARA荧光降低至背景水平表明真正的非复制 - 杀菌活性。然而，当R / NR-MIC 90比率表明化合物具有复制活性时（图1），有时NR-CARA荧光在浓度显着高于R-MIC 90且R-CARA- MBC≥99时降低。这种化合物可能是复制化合物，其NR-CARA荧光降低是由于木炭不能结合携带的化合物，对非复制细菌具有弱杀菌活性的化合物或其组合而导致的。下面针对卡那霉素描述了这种现象的一个例子。

活性炭结合抗分枝杆菌化合物。

我们首先比较了抗分枝杆菌化合物与活性炭或牛血清白蛋白级分V（BSA）的快速结合，然后测试了孵育时间对化合物与活性炭结合的影响。在第一个实验中，我们比较了0.4％活性炭（wt / vol）和0.5％BSA（wt / vol），即7H11-OADC琼脂中发现的BSA浓度。我们使用30μg/ ml和100μg/ ml的药物来模拟MIC 90高端的浓度测定，其中结转可能发挥重要作用。将化合物稀释到磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在室温下与含有木炭或BSA的PBS混合20分钟，然后通过10-kDa过滤器以保留木炭或BSA药物复合物。通过LC-MS定量未结合的药物（流穿液）。对于乙胺丁醇，乙硫异烟胺，fenamisal，异烟肼（INH），利奈唑胺，莫西沙星，对氨基水杨酸盐​​（PAS），链霉素和PA-824，<25％的化合物保留在BSA级分中。对于硝唑尼特，羟基保泰松和利福平，25％至75％的化合物保留在BSA部分中。换句话说，BSA未能快速结合> 75％的任何化合物。相比之下，20分钟后，活性炭已经去除了95％至100％的乙胺丁醇，乙硫异烟胺，fenamisal，利奈唑胺，硝唑尼特，羟基保泰松，PA-824，PAS和利福平，留下约1％至12％的莫西沙星和硝唑尼特和约55％至80％的异烟肼和链霉素未结合。当我们将孵育时间延长至18至24小时时，除乙醇丁醇（约3％未结合）和链霉素（58％未结合）外，活性炭结合所有化合物> 99.9％（表2）。

因此，对于每种测试的化合物，活性炭比BSA更快且更广泛地隔离药物。在许多情况下，100％的化合物在20分钟内被活性炭吸收，到24小时，活性炭几乎吸收了所有化合物> 99.9％。值得注意的例外是链霉素和乙胺丁醇（在较小程度上）。

活性炭对药物治疗结核分枝杆菌检测的影响。

接下来，我们测试了在琼脂中包含活性炭的影响，以允许从液体MIC 90测定中回收活的野生型复制或非复制的结核分枝杆菌（表2）。为此，我们比较了一组抗分枝杆菌化合物的NARA与CARA平板的结果。包含木炭对INH，利福平，莫西沙星，PAS，fenamisal，乙硫异烟胺，PA-824，TMC207和乙胺丁醇的表观活性有重要影响，但对羟基保泰松，硝唑尼特和链霉素影响不大（表2））用于有木炭和没有木炭的头对头比较; 相反，结果如下所示，用木炭进行重复实验。因为包含活性炭从未增加药物的表观效力并且仅降低某些药物的表观效力，其效果似乎不直接施用于结核分枝杆菌，而是具有在琼脂生长期期间抑制生长的潜力的药物。因此，作为常规，我们在微量培养板琼脂测定中包括活性炭，并使用所得的CARA来研究TB-活性剂对复制和非复制的结核分枝杆菌杆菌的影响。

在琼脂复制条件下携带PAS和fenamisal（表2）。在非复制条件（表2），在包括活性炭的影响轻微，例如不等，2至4倍，与PAS（可见图4a和和b），b），主要的，例如，128-折叠，与结构上相关的，但机械上不同药物（见于36）fenamisal（图4c和以及d）。d）。也就是说，fenamisal在其R-MIC 90处具有抑菌作用并且当在琼脂的恢复期存在木炭时，仅在浓度接近2个数量级时发挥杀菌活性。这表明，除非被木炭吸收，否则当从MIC板转移到基于琼脂的生长孔时，fenamisal继续抑制结核分枝杆菌的生长。

 

图4

0.4％（wt / vol）活性炭在7H11-OADC琼脂中对某些化合物的表观抗分枝杆菌活性的影响，可能是由于从肉汤MIC测定中吸附到琼脂培养物上的化合物。非复制性结核分枝杆菌暴露于对氨基水杨酸盐​​（PAS）或fenamisal 7天，从含有药物的MIC microtest平板上点样等分试样到含有无药琼脂和活性炭（CARA）或非炭“正常”琼脂（NARA）的微量试验板上。 。然后将CARA和NARA平板孵育7至10天，然后加入刃天青和吐温80.对于PAS，在CARA（a）和NARA（b）平板上生长之间几乎没有差异。对于fenamisal，通过添加活性炭（c，d）观察到大约64倍的移位。CARA数据来自与图7中相同的实验，并且为了说明的目的在此重复。结果是在两个相似实验之一中3次重复的平均值±SD。

MIC的比较90秒和结核病活性化合物的CARA。

然后我们测试的第一代和第二线抗结核药物和硝唑尼特简编，抗感染药用于其它适应症具有针对活性的结核分枝杆菌 在体外（37，38）（图5至TO9）。9）。该CARA结果区分4个类别的化合物：非复制杀菌，复制杀菌，复制-抑菌，和双活性，这意味着无论是复制-抑菌或复制杀菌以及非复制杀菌（表1和AND33）。

图5

非复制活性分子。（a）对主要具有非复制活性的化合物的预期结果的概述。在两个例子中，羟布宗（B，C）和硝唑尼特（d，e）中，先前被证明具有非复制-杀菌活性使用经典的基于CFU-测定（6，37）。

非复制活性分子。

严格的非复制活性分子的预期MIC 90，CARA和CFU结果显示在图5a和2，实施例7中。氧噻吩酮是一种非甾体抗炎药，之前已被确定为对非复制性结核分枝杆菌的选择性杀菌剂（6））。我们通过MIC和CARA测试羟基保泰松，同时复制结核分枝杆菌（图5b）和非复制性结核分枝杆菌（图5c）。NR-CARA数据与NR-MIC 90的数据平行，并正确预测羟基保泰松是一种选择性非复制活性化合物。正如R-MIC所预期的那样在数据中，R-CARA数据表明羟基保泰松没有可辨别的复制 - 杀菌活性。Nitazoxanide具有较弱的复制活性，并且在最小的非复制模型（7H9，pH 5.0，含有0.5mM NaNO 2 -）中对结核分枝杆菌具有杀菌作用（37）。从硝唑尼特处理的结核分枝杆菌的R（图5d）和NR（图5e）MIC 90和CARA获得的数据与公开的结果一致（37）。

R-杀菌分子。

严格复制的杀菌分子在R-MIC 90，R-CARA和R-CFU测定中显示活性（图6a和2，实施例1和2）。当使用NR-CARA时，减轻了导致有效复制活性物质的错误NR-MIC 90值的药物携带效应（图6a）。R-和NR-MIC 90为异烟肼和CARA数据（图6b和以及c），Ç），卡那霉素（图6d和ANDE），È）和链霉素（图6f和以及g）克与它们一致的是复制 - 杀菌化合物。NR-CARA清楚地证明INH（图6c）和链霉素（图6g）是非复制的无活性的，这表明NR-MIC 90数据是化合物携带的结果。

 

图6

复制 - 杀菌分子。总结了（a）严格复制 - 杀菌的化合物的预期结果，并显示了INH（b，c），卡那霉素（d，e）和链霉素（f，g）的实验例。

因为卡那霉素的R / NR MIC 90比率表明它是一种严格的复制活性化合物，我们预计NR-CARA结果可能来自化合物携带或抗生素后效应，而不是来自真正的非复制活性（图6e）。实际上，通过CFU测定对卡那霉素对非复制性结核分枝杆菌的活性进行的详细分析表明，随着药物浓度的增加，CFU适度降低，但未达到CARA预测的2至3 log 10杀灭（参见补充材料中的图S3b）。 ）。因此，在某些情况下，R / NR MIC 90比率是正确解释CARA数据的重要因素。

复制 - 抑菌分子。

复制-抑菌分子具有类似于复制杀菌化合物（的轮廓图7a中。和AND2，2，实施例3和4），但有以下区别：故障出现在R-CARA或的存在降低荧光与起始接种物相比，R-CARA中的静态窗口和<99％至99.9％CFU减少（图7a）。

对于PAS（图7b），fenamisal（图7d），TMC207（图7f），乙胺丁醇（图7h），利奈唑胺（图7j）和乙硫异烟胺（图7l），R-CARA结果没有跟踪R-MIC 90。R-CARA和R-MIC 90之间的静态窗口表明这些化合物具有抑菌作用，具有抗生素后效应，并且在测试的最高化合物浓度下可能仅具有杀菌活性。对于TMC207（图7f）和利奈唑胺（图7j）观察到大的静态窗口。利奈唑胺的结果证实了这种恶唑烷酮对复制具有抑菌作用的报道结核分枝杆菌（39）。相反，对于PAS和fenamisal，所述ÿ轴不得不扩展，以确定一个静态窗口（存在图7b和和d，d，插图）。PAS和fenamisal缺乏更明显的静态窗口可追溯到严重的抗生素后效应（参见补充材料中的图S4a和b）。

关于这些化合物的非复制活性，NR-CARA数据强烈表明PAS（图7c），fenamisal（图7e），TMC207（图7g），乙胺丁醇（图7i）和乙硫异烟胺（图7）都没有。.7m）具有显着的非复制活动。PAS，fenamisal和TMC207似乎在比其R-MIC 90高许多倍的浓度下具有非复制活性。虽然NR-MIC 90表明利奈唑胺可能在远高于其R-MIC 90值的浓度下杀死非复制性结核分枝杆菌（图7k）），NR-CARA结果明确预测利奈唑胺对非复制性结核分枝杆菌无活性（图7k）。通过CFU测定证实利奈唑胺的CARA预测用于复制（图7n）和非复制（图7o）结核分枝杆菌杆菌（表3）。

双活性分子。

如上所述，双活性分子对复制结核分枝杆菌具有杀菌或抑菌作用，并且对非复制性结核分枝杆菌具有杀菌作用（图8a和2，实施例5和6）。PA-824，莫西沙星和利福平的R-MIC 90至NR-MIC 90比率表明它们是双活性化合物。该CARA数据表明，PA-824被复制，抑菌/非复制杀菌（图8b和以及c），Ç），莫西沙星复制杀菌/非复制杀菌（图8d和ANDE），È），和利福平被复制杀菌/非复制杀菌（图8F和以及g）。g）。CFU分析证实为利福平的CARA的预测（参见图8H和ANDI我的补充材料），莫西沙星（见图S3C和在补充材料d），和PA-824（更详细地描述图9a和和bb）。

探讨PA-824和TMC207对复制和非复制结核分枝杆菌的影响。

该PA-824和TMC207分别为主要抑菌言下之意结核分枝杆菌是意想不到给出复制的条件下，使用测定CFU其他研究报道，PA-824和TMC207反对杀菌结核分枝杆菌 在体外和体内（40，41） 。为了测试是否在CARA板活性炭有可能影响的结论为PA-824和TMC207是否抑菌或杀菌，我们列举CFU在7H11-OADC板，缺乏或含有0.4％的活性炭（图9a至TOF ）。F）。对于PA-824和TMC207，包含活性炭显着增加CFU计数，而包含木炭不影响莫西沙星或卡那霉素的CFU计数（参见补充材料中的图S3）。与已报道的相似（42），与第7天相比，另外7天的TMC207暴露（总共14天）导致杀伤增加（图9e）; 然而杀保持在<3日志10时CFU进行计数在补充有活性炭琼脂平板上，这样的活性仍然可以通过杀菌活性的严格定义被分类为抑菌。在补充有活性炭的7H11-OADC平板上列举的CFU测定显示TMC207达到约2log 10杀灭非复制的多应激模型中的结核分枝杆菌（图7g），如NR-CARA- MBC≥99（12.5μg/ ml）所预测的。

因此，在补充或不补充0.4％活性炭的7H11-OADC琼脂平板上进行CFU测定增强了PA-824和TMC207的杀菌效果低于通常评分的印象，因为这一评分反映了处理后M的药物持续作用。结核杆菌是镀的。这通过以下实验证实。我们治疗结核分枝杆菌用30μg/ ml的PA-824或TMC207培养7天，并将未稀释的细胞涂布在琼脂平板上。我们在缺乏木炭的7H11-OADC平板上恢复了0到2个菌落。相反，当将相同的药物处理的未稀释细胞涂布在含木炭的7H11-OADC琼脂平板上时，有太多的菌落计数（参见补充材料中的表S1）。这清楚地说明了遗留药物给出错误的cidality和活性炭结合携带药物的能力。