发布日期：2018-11-12 09:43 来源：活性炭网 作者：活性炭网 浏览数：
儿童非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为影响青少年健康的最常见肝病，也是中国富裕家庭儿童中影响最大的慢性肝病之一，特别是在沿海地区。 然而，可用于治疗NAFLD的药物是不足的
随着肥胖的全球化和年轻时代的潮流，非酒精性脂肪肝病（NAFLD）已经成为发达国家的儿童和富裕的中国家庭中最常见的慢性肝脏疾病之一，特别是在沿海地区（1 - 5）。二肽基肽酶IV（DPPIV）是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，T细胞活化蛋白和腺苷脱氨酶结合蛋白，也称为分化簇26.除了肽酶的水解活性外，它还对脂肪代谢具有调节作用，免疫和炎症（6）。以前的研究的结果，已经揭示，DPPIV的活性与慢性肝脏疾病，包括NAFLD（相关联的7 - 9）。此前，Machado 等人（10）和Qu 等人（11）将强效抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和活性炭有效地结合在一起，具有良好的吸附性能和生物相容性，并制备了NAC活性炭缓释微胶囊（ ACNAC）。ACNAC减少了NAC的各种副作用，并延长了药物的半衰期和生物利用度。根据以往的研究（12 - 15），本研究旨在通过建立NAFLD幼鼠模型，进一步探讨ACNAC对NAFLD幼鼠的影响，以检测血清DPPIV活性水平和肝脏中DPPIV蛋白的表达。本研究讨论了ACNAC是否是DPPIV抑制剂，以及它是否能够保护NAFLD幼鼠。
共有64只健康，清洁，断奶的Sprague-Dawley雄性大鼠（体重51.93±4.28g; 21日龄）购自浙江省医学科学院动物中心[杭州; 动物许可证号：SCXK（Zhe）2014-0001]。大鼠随意进食获得标准的商业饮食和水，但术前禁食除外，并在整个实验过程中保持在22±1℃，40-60％相对湿度，12小时光照/黑暗循环的房间内。所有实验均按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南进行，并获得浙江中医药大学附属西溪医院动物护理委员会（杭州，中国）的批准。在对这些病症适应1周后，将大鼠随机分成以下组（每组n = 8）：正常组，喂食标准饮食; 模型组; 喂食高脂肪饮食（69％基础饲料，10％猪油，2％胆固醇，5％糖，0.5％胆酸盐，10％蛋黄粉，3％酵母粉和0.5％十二碳四烯酸）; 多烯磷脂酰胆碱基; 每天通过胃灌注给予60mg / kg PPC（Sanofi-aventis;中国北京）并喂食高脂饮食; NAC组每天通过胃灌注给予60mg / kg NAC（Whu hoyo Co.，Ltd，Wuhan，Hubei）并喂食高脂饮食; 活性炭释放微胶囊组，给予60 mg / kg活性炭释放微胶囊（浙江杭州浙江杭州木业有限公司）喂食高脂饮食; 和ACNAC低剂量，中剂量和高剂量组，喂食高脂肪饮食并给予15,30和60 mg / kg ACNAC [如前所述内部制造]（活性炭释放微胶囊组，给予60 mg / kg活性炭释放微胶囊（浙江杭州浙江杭州木业有限公司）喂食高脂饮食; 和ACNAC低剂量，中剂量和高剂量组，喂食高脂肪饮食并给予15,30和60 mg / kg ACNAC [如前所述内部制造]（活性炭释放微胶囊组，给予60 mg / kg活性炭释放微胶囊（浙江杭州浙江杭州木业有限公司）喂食高脂饮食; 和ACNAC低剂量，中剂量和高剂量组，喂食高脂肪饮食并给予15,30和60 mg / kg ACNAC [如前所述内部制造]（12 - 15）]，分别每天进行胃灌注。在这些处理7周后，处死幼鼠，收集它们的血液和肝脏并储存在-80℃下备用。
计算肝脏湿重和幼鼠的体重。根据下式计算肝脏指数：肝脏指数（％）=肝脏湿重/体重×100。
来自每组大鼠的新鲜肝组织在4％多聚甲醛中在室温下处理24小时，用根据设定梯度（75,85,90,95和100％）制备的醇脱水，然后包埋到石蜡块中。随机选择总共5个块，并且每个块在石蜡切片机上切成三个切片，厚度为4-μm。将切片在二甲苯中脱蜡，在二甲苯中包埋20分钟，二甲苯II保持20分钟，无水乙醇I保持10分钟，无水乙醇II保持10分钟，95％酒精保持5分钟，90％酒精保持5分钟，在用水洗涤之前，依次用80％乙醇处理5分钟和70％酒精处理5分钟。用苏木精染色细胞核：切片用苏木精染色3-8分钟，曙红染色1-3分钟。
使用Hitachi 7060自动生化分析仪（Hitachi，Ltd.，Tokyo，Japan）检测血清丙氨酸转氨酶（ALT; Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan），天冬氨酸转氨酶（AST; Wako Pure Chemical Industries，Ltd） 。，大阪，日本），总胆固醇（TC;北京霍马生物工程有限公司，中国北京），总甘油三酯（TG;北京霍马生物工程有限公司），高密度脂蛋白胆固醇（HDL） -C;浙江宁波医疗系统生物科技有限公司），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C; Medicalsystem Biotechnology Co.，Ltd。），空腹血糖（FBG; Autec Diagnostic; Baden-Württemberg，Germany） 。使用雅培i2000（Abbott Molecular Inc.，Chicago，IL，USA）检测血清空腹胰岛素（FINS; Abbott Molecular Inc.）。
根据制造商的DPPIV试剂盒（AAT Bioquest Inc.，California，USA）的说明进行操作。将总共5mg Gly-Pro-AMC（敏感的荧光底物;分子量，443.37）引入563.5μl二甲基亚砜（DMSO）中以制备20mM底物DMSO储备溶液。将底物DMSO储备溶液稀释到含有50mM Tris-HCl的100μM底物DMSO储备溶液中，并在室温下与大鼠血清（150μl：150μl）混合1小时。用酶标记的仪器（Biotek Corporation; Broadview，IL，USA）在Ex / Em = 380 / 500nm下测量荧光强度。DPPIV的活性抑制率用以下等式计算（16）：DPPIV的活性抑制率=（阴性对照组的荧光强度 - 各给药组的荧光强度）/阴性对照组的荧光强度×100％。
如HE染色中所述，用甲醛固定肝组织并用梯度乙醇水合。在柠檬酸盐缓冲液抗原修复后，将切片与3％去离子水一起温育20分钟，然后用PBS洗涤5分钟，3次。在室温下用5-10％正常山羊血清（Boster Biological Technology Co.，Ltd。）封闭25分钟后，将4μm厚的切片与DPPIV一抗孵育（目录号10940_1_ap; 1：100; Proteintech组） ，公司，湖北武汉）在4°C过夜。随后，将样品与山羊抗兔二抗（目录号GB23303; 1：200;武汉古德比奥科技有限公司，武汉，湖北）在室温下孵育50分钟。用3,3'-二氨基联苯胺试剂在室温下显色5分钟后，在光学显微镜（放大倍数，×400; Nikou Corporation）上安装和观察切片，并且棕黄色肝细胞膜的外观显示阳性表达。共选择了5个非重叠视野和免疫组化评分（IHS）方法（17）用于根据阳性细胞的百分比及其染色强度对样品进行评分，并用Image Pro-Plus 6.0版（Media Cybernetics，Rockville，Maryland，USA）分析结果。
从肝脏组织中提取总蛋白质。使用全蛋白提取试剂盒（南京KeyGEN Biotech Co.，Ltd.，Nanjing，China）提取总样品蛋白。将肝组织（100mg）置于培养皿中并切成块（约3×3mm），加入0.5-1ml 0-4℃裂解缓冲液，其中含有5μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和5μl100mM苯甲基磺酰氟。将混合物在4℃下均化15次，然后在4,6℃下以10,625×g离心15分钟。收集上清液并使用BCA方法进行蛋白质定量：用紫外分光光度计在562nm处读取吸光度。总共将20μg蛋白质加载到每个孔中并在60mA下进行5％SDS-PAGE。然后将蛋白质以100V恒定电压转移到聚偏二氟乙烯膜上65分钟，并使用5％脱脂奶粉在4℃温育过夜。将PVDF膜与DPPIV和β-肌动蛋白一抗（1：500，Abcam; Cambridge，UK）在室温下孵育2小时，然后用含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水（PBST）洗涤3次，每次10分钟。将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（目录号ab97200; 1：1,000; Abcam，Cambridge，England）在室温下孵育1小时，并用PBST洗涤3次，每次10分钟。在使用前制备二氨基联苯胺显影剂。将洗过的PVDF膜放入显影剂中3分钟，然后用水终止二氨基联苯胺反应。
数据表示为平均值±标准偏差。使用单向方差分析进行组间比较，当方差相等时，使用最小显着差异方法进行组间的成对比较。此外，当方差不相等时，Games-Howell方法用于组间的成对比较。使用SPSS 18.0版软件（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）进行统计分析。P <0.05被认为表示统计学上显着的差异。
与正常组相比，模型组肝脏指数显着增加（P <0.05）。与模型组相比，ACNAC组肝脏指数显着降低（P <0.05），高剂量组最明显降低。在ACNAC高剂量组和PPC组之间未观察到肝指数的显着差异（图1）。
各组幼鼠肝脏指数，血清DPPIV活性抑制率和DPPIV表达率的比较结果。（A）肝脏指数，（B）DPPIV抑制和（C）DPPIV表达率。条形代表每个实验组获得的结果的平均值±标准偏差。* P <0.05与通过单因素方差分析和最小显着差异方法确定的模型组相比。正常，正常组; 模型，模型组; PPC，多烯磷脂酰胆碱基; NAC，N-乙酰半胱氨酸对照组; AC，活性炭释放微胶囊对照组; ACNAC1，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量组; ACNAC2，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量组; ACNAC3，N - 乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组; DPPIV，二肽基肽酶IV。
在正常组和光学显微镜下，幼鼠肝组织结构清晰完整。此外，肝小叶的结构是正常的，肝细胞以放射性排列分布在中央静脉周围。在模型组中，幼鼠肝细胞中的脂肪变性显着增加。此外，弥漫性肝细胞脂肪变性伴有气球样变性，肝细胞斑点坏死伴有中央静脉周围的肝纤维化。与模型组相比，在ACNAC组，尤其是高剂量组，幼鼠肝组织的脂肪变性和气球样变性程度明显减轻，在中央静脉中没有明显的炎性细胞浸润或局灶性坏死。此外，与模型组相比，PPC组没有明显的脂肪变性和偶尔的微泡脂肪液滴空泡。最后，在PPC和ACNAC高剂量组之间没有观察到显着差异（图2）。
活性炭释放微胶囊对非酒精性脂肪性肝病幼年肝脏脂肪变性的影响。每组苏木精和伊红染色（放大倍数×400）的幼鼠肝组织病理学检查结果。（A）正常，（B）模型，（C）多烯磷脂酰胆碱，（D）N-乙酰半胱氨酸对照，（E）活性炭释放微胶囊对照，（F）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量，（G） ）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量和（H）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组。
与模型组相比，高剂量ACNAC组ALT，AST，TC，TG，LDL-C，FBG和FINS显着降低，HDL-C水平升高（P <0.05）。（; P> 0.05此外，在ACNAC高剂量和PPC组之间的TC，TG，LDL-C和HDL-C水平中没有观察到差异显著-图3和AND44）。
各组幼鼠ALT，AST，FBG和FINS血清的比较结果。（A）ALT，（B）AST，（C）FBG和（D）FINS。条形代表每个实验组获得的结果的平均值±标准偏差。*通过单因素方差分析和最小显着差异方法确定，与模型组相比，P <0.05。正常，正常组; 模型，模型组; PPC，多烯磷脂酰胆碱基; NAC，N-乙酰半胱氨酸对照组; AC，活性炭释放微胶囊对照组; ACNAC1，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量组; ACNAC2，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量组; ACNAC3，N - 乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组; ALT，丙氨酸转氨酶; AST，天冬氨酸转氨酶; FBG，空腹血糖; FINS，禁食胰岛素。
各组幼鼠TC，TG，HDL-C和LDL-C血清的比较结果。（A）TC，（B）TG，（C）LDL-C和（D）HDL-C。条形代表每个实验组获得的结果的平均值±标准偏差。*通过单因素方差分析和最小显着差异方法确定，与模型组相比，P <0.05。正常，正常组; 模型，模型组; PPC，多烯磷脂酰胆碱基; NAC，N-乙酰半胱氨酸对照组; AC，活性炭释放微胶囊对照组; ACNAC1，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量组; ACNAC2，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量组; ACNAC3，N - 乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组; TC，总胆固醇; TG，总甘油三酯; LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇; HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇。
将血清加入到功能完整的酶标准仪器中以检测ACNAC对DPPIV活性的抑制作用。与正常组相比，模型组血清DPPIV活性抑制率显着降低-29.54±13.32％（P <0.05）。与模型组相比，高剂量ACNAC组血清DPPIV活性抑制率显着提高49.50±5.56％（P <0.05）。与PPC组相比，抑制率为46.42±5.88％，ACNAC高剂量组血清DPPIV活性抑制率增加，组间差异增大; 然而，这没有统计学意义（P> 0.05; 图1）。
DPPIV的阳性表达由棕黄色肝细胞膜指示。与正常组肝细胞膜DPPIV阳性细胞百分比（89.19±6.23％）相比，模型组阳性细胞表达率（43.48±4.99％）显着降低（P <0.05）。与模型组相比，ACNAC组肝细胞膜中DPPIV阳性细胞百分比显着升高（P <0.05），DPPIV阳性表达随着肝组织脂肪变性的减少而增加，尤其是在高剂量ACNAC组中，阳性细胞的百分比（68.57±6.48％）最显着增加。与PPC组（67.90±6.45％）相比，ACNAC高剂量组DPPIV阳性细胞阳性细胞百分比略有增加;图 1和AND55）。
免疫组织化学检测各组幼鼠肝组织中的二肽基肽酶IV。DPPIV的免疫组织染色的代表性图像用棕黄色染色（放大倍数，×400）表示。（A）正常，（B）模型，（C）多烯磷脂酰胆碱，（D）N-乙酰半胱氨酸对照，（E）活性炭释放微胶囊对照，（F）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量，（G） ）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量和（H）N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组。
与正常组相比，模型组DPPIV蛋白表达显着降低（P <0.05）。与模型组相比，低剂量，中剂量和高剂量ACNAC组中DPPIV蛋白表达以剂量依赖性方式显着增加（P <0.05; 图6）。
通过蛋白质印迹分析检测DPPIV蛋白质表达的结果。*与模型组相比，P <0.05。正常，正常组; 模型，模型组; PPC，多烯磷脂酰胆碱基; NAC，N-乙酰半胱氨酸对照组; AC，活性炭释放微胶囊对照组; ACNAC1，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊低剂量; ACNAC2，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊中剂量和ACNAC3，N-乙酰半胱氨酸活性炭释放微胶囊高剂量组; DPPIV，二肽基肽酶IV。
NAFLD已成为最常见的肝脏疾病影响的儿童和青少年（对健康的18 - 20）。根据之前的一项研究，NAFLD患者最有可能在美国的7000万人中占30％，在2至19岁之间的儿童和青少年中占8％（20）。儿童的发病机制可能与成人不同; 然而，总体发病趋势是单纯性脂肪肝，脂肪肝肝炎，肝纤维化甚至肝硬化（21）。因此，有必要尽快屏，这样的疾病风险的儿童，并研究发病机制（22，23）。对于肥胖儿童NAFLD，任何不健康的饮食和生活习惯应予以纠正（24 - 26），有氧运动鼓舞，他们的体重应该控制在减轻胰岛素抵抗，使肝脏的损害可能在早期阶段被逆转（27 - 29）。如果需要，药物干预的毒性和副作用，并明显疗效的低水平可用于有效地降低NAFLD和其他慢性代谢性疾病在儿童中的发生（30，31）。
目前，儿童用药面临的主要问题是药品安全信息不完善，缺乏药用品种（32），规格和特殊配方，导致儿童多药，各种缺点（33）。为了解决这些问题，中国增加了口服缓释疗法，控释制剂，口腔崩解片和透皮吸收制剂的投入，目的是开发符合婴幼儿用药特点的制剂。具有低毒性，副作用少和生物利用度高（34）。对于本研究，吸附行为和体外的优势 考虑了药物活性炭的释放特性，研究了活性炭NAC缓释微胶囊，以提高NAC的氧化性和生物利用度，减少临床用量，提高药物稳定性，阐明理想的婴幼儿药物制剂。儿童。
DPPIV广泛存在于生物体中，其表达主要在上皮细胞，淋巴细胞，内皮细胞和成纤维细胞中。以前的研究已经证明，DPPIV对生物活性（多效35，36），特别是在已知的DPPIV蛋白酶影响脂肪代谢，通过神经肽Y的生物体的主要脂质代谢和其它多肽的失活。
本研究采用高脂饮食诱导NAFLD幼鼠模型，并结合儿童的饮食结构和习惯，建立腹部肥胖，脂质代谢紊乱和肝酶水平升高的幼年动物模型，与儿童相似与NAFLD。结果表明，与正常组相比，模型组体重增加，肝脏指数增加，内脏脂肪沉积，肝脏体积明显增加，肝脏呈灰黄色，幼鼠表面有油腻感。另外，通过HE病理学染色观察到不同程度的脂肪变化和气球样变性。此外，不同大小的空泡被填充在细胞中，并且各个区域伴有炎性细胞浸润和偶尔的局灶性坏死。
Balaban 等人先前的一项研究（37）表明，非酒精性脂肪性肝炎患者血清中DPPIV的活性明显高于正常组。此外，NAFLD肝组织病理变化程度和肝细胞脂肪变化程度与血清DPPIV活性和蛋白表达强度有关。据认为，DPPIV可能与NAFLD的发病机制密切相关（38）。先前已经发现，DPPIV抑制剂可以改善大鼠肝脏的脂肪变性（39）。此外，先前的临床实验证明，DPPIV抑制剂还可以改善NAFLD患者的肝细胞转氨酶水平和气球样变性（40）。本实验结果表明，与模型组相比，ACNAC组（特别是高剂量组）在上述指标中表现出不同程度的改善，降低了ALT，AST和DPPIV的活性以及TC的含量。 ，TG，LDL-C，FBG和FINS，增加HDL-C含量，增强肝细胞膜中DPPIV蛋白的表达。这与Balaban 等人进行的研究结果一致（37）。这些研究结果表明，ACNAC可能具有DPPIV抑制剂治疗幼年大鼠NAFLD的作用，为幼年大鼠NAFLD /非酒精性脂肪性肝炎研究中NAC的使用提供了新的理论依据，为理想的理论知识提供了理论依据。婴儿和儿童的药物制剂。然而，潜在的机制仍有待在未来的实验中进行研究。
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